Anatomia & Fisiologia

La microscopia è il campo tecnico dell’uso di microscopi (strumento di ingrandimento) per vedere oggetti e aree di oggetti che non possono essere visti a occhio nudo (oggetti che non sono nel raggio di risoluzione dell’occhio normale).17 Il microscopio è un dispositivo che usa una lente o un sistema di lenti per produrre un’immagine notevolmente ingrandita di un oggetto. La microscopia moderna ora utilizza software come ImageJ, CellProfiler, NeuronStodio per acquisire e analizzare le immagini.1

Ci sono due rami della microscopia.1,18

1. Microscopio ottico (microscopio semplice, composto, microscopio da dissezione (stereo microscopio), microscopio a confronto, microscopio invertito, microscopio chirurgico e digitale.
2. Microscopio elettronico (microscopio elettronico a trasmissione e a scansione)

Microscopio ottico

Questo si riferisce anche al microscopio ottico, è un tipo di microscopio che utilizza la luce visibile e un sistema di lenti per ingrandire le immagini di piccoli campioni.17 I microscopi ottici sono il più antico tipo di microscopio e sono stati probabilmente inventati nella loro attuale forma composta nel 17° secolo. I microscopi ottici di base possono essere molto semplici, anche se ci sono molti modelli complessi che mirano a migliorare la risoluzione e il contrasto del campione, come il microscopio composto, il microscopio da dissezione e il microscopio chirurgico.19 I microscopi moderni permettono più della semplice osservazione dell’immagine di un campione in luce trasmessa; ci sono molte tecniche che possono essere usate per estrarre altri tipi di dati. La maggior parte di queste richiedono attrezzature aggiuntive oltre ad un microscopio composto di base.17 La microscopia ottica è ampiamente utilizzata in istologia, istopatologia, microelettronica, nanofisica, biotecnologia, ricerca farmaceutica, mineralogia e microbiologia.20

Microscopio semplice: Un microscopio semplice usa una lente o un insieme di lenti per ingrandire un oggetto attraverso il solo ingrandimento angolare, dando all’osservatore un’immagine virtuale eretta e ingrandita.21 L’uso di una singola lente convessa o gruppi di lenti si trovano ancora in dispositivi di ingrandimento semplici come la lente d’ingrandimento, le lenti d’ingrandimento e gli oculari per telescopi e microscopi.22

Microscopio composto: Un microscopio composto utilizza una lente (obiettivo) vicino all’oggetto da osservare per raccogliere la luce che focalizza un’immagine reale dell’oggetto all’interno del microscopio. Quell’immagine viene poi ingrandita da una seconda lente o gruppo di lenti (chiamato oculare) che dà all’osservatore un’immagine virtuale invertita ingrandita dell’oggetto.18 L’uso di una combinazione di obiettivo composto/oculare permette un ingrandimento molto maggiore (fino a 1000-2000 volte) (Figura 7). Un microscopio composto permette anche configurazioni di illuminazione più avanzate, come il contrasto di fase.21,22

Microscopio stereo: Uno stereo microscopio è un microscopio a bassa potenza che fornisce una visione stereoscopica di un campione (fino a 100 volte l’ingrandimento), comunemente usato per la dissezione (Figura 8).18

Microscopio rovesciato: per studiare i campioni dal basso; utile per le colture cellulari in liquido, o per la metallografia (Figura 9).18

Microscopio comparatore: È un dispositivo utilizzato per analizzare campioni affiancati. Consiste in due microscopi collegati da un ponte ottico, che si traduce in una finestra di visione divisa che permette di vedere simultaneamente due oggetti separati. Ha due percorsi di luce separati che permettono il confronto diretto di due campioni attraverso un’immagine in ogni occhio (Figura 10). Questo evita che l’osservatore debba fare affidamento sulla memoria quando confronta due oggetti sotto un microscopio convenzionale.27

Microscopio digitale: È una variante di un microscopio ottico tradizionale che utilizza un’ottica e una fotocamera digitale per produrre un’immagine su un monitor, a volte per mezzo di un software che gira su un computer.20 Un microscopio digitale ha spesso la sua sorgente di luce LED incorporata, e differisce da un microscopio ottico in quanto non vi è la possibilità di osservare il campione direttamente attraverso un oculare. Poiché l’immagine è focalizzata sul circuito digitale, l’intero sistema è progettato per l’immagine del monitor (Figura 11). Gli oculari per l’occhio umano sono omessi.20

Microscopio chirurgico: Sono utilizzati per aumentare l’ingrandimento del chirurgo (fino a 4-40 volte) durante le procedure chirurgiche.29 Sono stati originariamente utilizzati per la chirurgia dell’orecchio, del naso e della gola. Tuttavia, stanno ancora stabilendo nuovi standard in chirurgia generale, oftalmologia, chirurgia ortopedica, chirurgia ginecologica, otorinolaringoiatria, neurochirurgia, chirurgia orale e maxillofacciale, chirurgia plastica, chirurgia podologica e chirurgia pediatrica (Figura 6).29

Microscopio elettronico

Il design generale di un microscopio elettronico è simile a quello di un microscopio ottico. La luce è sostituita da elettroni, le lenti di vetro sono sostituite da lenti elettromagnetiche ed elettrostatiche. I microscopi elettronici hanno sistemi di lenti ottiche elettroniche che sono analoghe alle lenti di vetro di un microscopio ottico a luce, ci sono due tipi principali di microscopi elettronici; microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e microscopio elettronico a scansione (SEM), di cui il TEM è il più comunemente usato (Figura 12).22 Il più grande vantaggio è che hanno una risoluzione più alta del microscopio a luce e sono quindi anche in grado di un maggiore ingrandimento (fino a 2 milioni di volte).31 I microscopi elettronici permettono la visualizzazione di strutture che normalmente non sarebbero visibili con la microscopia ottica.32 I microscopi elettronici sono usati per studiare l’ultrastruttura di un’ampia gamma di campioni biologici e inorganici, inclusi microrganismi, cellule, grandi molecole, campioni bioptici, metalli e cristalli (Figura 13).31 I moderni microscopi elettronici producono micrografie elettroniche usando fotocamere digitali specializzate e frame grabber per catturare l’immagine.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

La microscopia elettronica a trasmissione è una tecnica sviluppata per ottenere ingrandimenti e quindi dettagli di un campione, ad un livello molto migliore dei microscopi ottici convenzionali.34,35 Nel TEM un fascio di elettroni viene fatto passare attraverso un campione ultrasottile, interagendo con il campione al suo passaggio. Un’immagine è formata dall’interazione degli elettroni trasmessi attraverso il campione; l’immagine è ingrandita e focalizzata su un dispositivo di imaging, come uno schermo fluorescente, su uno strato di pellicola fotografica, o per essere rilevata da un sensore come una telecamera CCD.2 In un TEM, gli elettroni penetrano in un campione sottile e sono poi ripresi da lenti appropriate, in larga analogia con il microscopio biologico a luce.22 Il TEM comprende: sistema di illuminazione, palco per campioni, sistema di imaging e sistema a vuoto. La microscopia elettronica a trasmissione è un importante metodo di analisi nelle scienze fisiche, chimiche e biologiche. I TEM trovano applicazione nella ricerca sul cancro, nella virologia e nella scienza dei materiali così come nell’inquinamento, nella nanotecnologia e nella ricerca sui semiconduttori.36

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Un microscopio elettronico a scansione ha una struttura simile al TEM, ma la colonna è notevolmente più corta perché le uniche lenti necessarie sono quelle sopra il campione usate per focalizzare gli elettroni in un punto sottile sulla superficie del campione.37 Non ci sono lenti sotto il campione. La camera del campione, d’altra parte, è più grande perché la tecnica SEM non impone alcuna restrizione sulla dimensione del campione oltre a quella stabilita dalla dimensione della camera del campione.38 Il SEM produce immagini di un campione scansionando la superficie con un fascio concentrato di elettroni. Gli elettroni interagiscono con gli atomi nel campione, producendo vari segnali che contengono informazioni sulla topografia e la composizione della superficie del campione.39 Il fascio di elettroni viene scansionato in un modello di scansione raster, e la posizione del fascio viene combinata con il segnale rilevato per produrre un’immagine. Il SEM può raggiungere una risoluzione migliore di 1 nanometro.40

Ultrasonografia

L’ultrasonografia è anche chiamata studio Doppler o ecografia usata per la diagnosi medica, è una tecnica indolore e non invasiva che usa una macchina a ultrasuoni con onde sonore silenziose ad alta frequenza (da 1 a 5 megahertz) per produrre immagini dal vivo delle strutture interne del corpo, note anche come sonogramma. Permette ai medici di visualizzare organi o tessuti malati o normali (come vescica, utero, reni e ovaie) all’interno del corpo senza fare un’incisione. L’ecografia è la tecnica medica raccomandata per la visualizzazione di un feto nelle donne incinte/animali perché non produce radiazioni come altre tecniche di imaging medico.2

La tecnica dell’ecografia comporta l’uso di un gel liquido e di una sonda trasduttrice tenuta a mano sulla superficie del corpo. La sonda che contiene il trasduttore acustico invia e riceve milioni di impulsi ed echi nel corpo al secondo. Le onde sonore penetrano nel corpo e colpiscono un confine tra i tessuti (per esempio tessuti molli e ossa), le onde vengono riflesse indietro alla sonda del trasduttore e poi trasmesse all’unità di elaborazione centrale (CPU) (Figura 14-16). La CPU è una macchina che fornisce energia elettrica al trasduttore, calcola il tempo di riflessione dell’onda e la profondità dell’interfaccia del tessuto che causa l’onda in modo da costruire un’immagine bidimensionale sul monitor. La procedura richiede solitamente un minimo di 30 minuti.41,42

Di seguito i diversi tipi di ecografia

Immagine ecografica 2D: Questo è il tipo più comune di immagine ecografica, è una serie di immagini piatte e bidimensionali in sezione trasversale del tessuto scansionato. Questa modalità di scansione è ancora standard per molte situazioni diagnostiche e ostetriche dopo mezzo secolo di utilizzo.43-46

Immagine ecografica 3D: Si tratta di un’immagine tridimensionale (3D), ottenuta da una sezione trasversale di tessuto scansionata a più angoli e i dati ricevuti vengono ricostruiti in un’immagine tridimensionale. Questa ecografia è comunemente usata per fornire un sonogramma (immagine) più completo e realistico di un feto e nella diagnosi della labiopalatoschisi.44-47

Immagine ecografica 4D: utilizza l’onda sonora per produrre un video dal vivo del feto nell’utero.43-46 L’ecografia 3D e 4D produce un’immagine realistica di un feto in movimento o in via di sviluppo nell’utero che non può essere visto facilmente in un’immagine ecografica 2D.43-46

Un’immagine ecografica Doppler: La tecnica comporta l’uso di onde sonore riflesse per rivelare il modello e il modo del flusso di sangue all’interno del vaso sanguigno, questo non può essere visto in un’immagine ecografica 2D, 3D e 4D. L’ecografia Doppler può essere utilizzata per diagnosticare diverse anomalie del cuore e dei vasi sanguigni come l’insufficienza venosa, la stenosi delle arterie, i coaguli di sangue, gli aneurismi e le malattie congenite del cuore. Durante un’ecografia Doppler il trasduttore viene spostato sulla pelle lungo i vasi sanguigni per inviare e riflettere le onde sonore, le onde sonore ad alta frequenza rimbalzano sulle cellule del sangue in circolazione, che in cambio cambia la frequenza delle onde riflesse, si riferisce a un effetto Doppler e in assenza di flusso di sangue, i cambiamenti non si verificano nelle onde sonore riflesse. I dati delle onde sonore riflesse con effetti Doppler vengono utilizzati per costruire un grafico che rappresenta il modello e il modo in cui il sangue scorre attraverso i vasi sanguigni sulla CPU. Ci sono tre tipi di ultrasuoni Doppler: Color Doppler, Spectral Doppler e Power Doppler.43-46

Color doppler: Questo tipo di ultrasuono usa il tradizionale ultrasuono 2D per creare l’immagine di un vaso sanguigno e usa un computer per cambiare le onde sonore Doppler in colori che rappresentano la direzione e la velocità del flusso sanguigno sull’immagine del vaso sanguigno.43-46

Power doppler: Questo è un tipo più sensibile di Doppler a colori che viene utilizzato per generare dettagli del flusso sanguigno in un organo solido che non può essere visualizzato utilizzando un Doppler a colori convenzionale. Tuttavia è impossibile visualizzare la direzione del flusso sanguigno utilizzando l’ecografia power Doppler. 43-46

Spectra doppler: Questo è un tipo di ecografia che utilizza un grafico per rappresentare il flusso e la direzione del sangue. È in grado di mostrare il grado di ostruzione in un vaso sanguigno.43,45

Doppler a onde continue: Questa ecografia utilizza onde sonore che vengono inviate e riflesse continuamente. Questo tipo di onde sonore sono usate per rilevare un blocco nei vasi sanguigni e misurare accuratamente il sangue che scorre velocemente.43-46

Radiografia

Questa è la più antica e comune tecnica di diagnostica per immagini.3 È una tecnica non invasiva come l’ultrasonografia, tuttavia utilizza una quantità molto piccola di radiazioni ionizzanti o non ionizzanti (raggi X) generate da una macchina a raggi X per produrre un’immagine latente delle strutture interne del corpo su una pellicola a raggi X (Radiografia a proiezione). Una macchina a raggi X può essere fissa, mobile o portatile (Figura 17-19).48-51 Durante la radiografia, i raggi X sono diretti verso il corpo permettendo di passare attraverso l’organo bersaglio e poi catturati dietro la pellicola a raggi X piatta per produrre un’immagine 2D (Figura 20). L’esame radiografico può essere fatto con o senza un mezzo di contrasto (come il bario o lo iodio) a seconda della densità dell’organo da esaminare. La radiografia può essere usata per diagnosticare diverse condizioni come la frattura delle ossa e il cancro, il tumore al seno e la tubercolosi.48 Ci sono alcuni rischi associati all’eccesso di esposizione ai raggi X come il cancro, la perdita di capelli e le ustioni della pelle. Ma nella maggior parte dei casi i benefici superano i rischi.3,52

Tomografia computerizzata (TC)

La TC è un tipo di radiografia che utilizza anche i raggi X, a differenza della radiografia a proiezione la TC utilizza una maggiore quantità di raggi X e fornisce un’immagine 3D più dettagliata, tuttavia negli ultimi anni, alcune TC sono state sviluppate per utilizzare una minore quantità di raggi X. La macchina CT comprende uno scanner CT a forma di ciambella, un tavolo, un tubo a raggi X, un rilevatore di raggi X e un computer (Figura 21).54,55 Il paziente giace sul tavolo prima di scivolare nello scanner CT, il tubo a raggi X e la telecamera si muovono intorno al paziente a 360° per scansionare e produrre immagini multiple degli organi interni del corpo, a seconda dell’organo di interesse potrebbe essere somministrato un materiale di contrasto o attraverso la bocca, il retto o iniettato in vena per evidenziare l’organo scansionato.55 La scansione viene eseguita in una sala computer separata dove le immagini vengono visualizzate e il tecnologo comunica con il paziente con l’aiuto di altoparlanti e microfoni.56 Il vantaggio principale della TAC è la rapida acquisizione di immagini diagnostiche più chiare di una parte più ampia del corpo.56,57

Ci sono scanner CT veterinari specializzati come lo scanner CT veterinario ricaricabile, questo scanner è dotato di un armadio a raggi X per permettere al veterinario di stare vicino all’animale durante la scansione, in quanto tale non è necessaria una stanza separata come nella tradizionale scansione CT umana (Figura 22).57 Durante la scansione, l’animale sarà anestetizzato e monitorato, posto e sostenuto su un tavolo mobile prima di scivolare nello scanner CT (Figura 23).60,61

Risonanza magnetica (MRI)

La risonanza magnetica (MRI) è una tecnica di diagnostica per immagini indolore e non invasiva che utilizza un potente campo magnetico e onde radio per creare un’immagine 3D degli organi interni del corpo. La risonanza magnetica non comporta radiazioni come nella radiografia (radiografia a proiettile, TAC e PET).4 La macchina per la risonanza magnetica è simile a quella della TAC e della PET, anche se la tecnica richiede più tempo e fa più rumore (Figura 24).5,61,63

Durante la scansione il paziente (con o senza mezzo di contrasto) giace su un tavolo che scorre nel tubo contenente un grande magnete che genera un campo magnetico e onde radio intorno al corpo del paziente che permettono ai tessuti del corpo di vibrare. Queste vibrazioni sono convertite in immagini dettagliate sul computer (Figura 25).5

Tomografia a emissione di positroni (PET)

PET è una tecnica di imaging funzionale 3D, in contrasto con CT e X-ray, dimostra le attività fisiologiche dei tessuti e degli organi del corpo utilizzando un radiotracciante (18F-FDG). La via di somministrazione (orale, venosa o nasale) del radiotracciante dipende dal tessuto o dall’organo di interesse.64 Il radiotracciante iniettato si concentra in un tessuto che viene visualizzato su un computer come immagine 3D. La macchina è simile alla CT e alla MRI, e le moderne immagini della PET possono essere combinate con la CT o la MRI per creare una visione unica (Figura 26).66

La PET è principalmente usata nello studio e nella diagnosi di tumori e disturbi associati al cervello e al cuore. La tecnica è anche indolore e non invasiva, tuttavia, non è raccomandata per le donne incinte, madri che allattano a causa delle radiazioni emesse dal radiotracciante 18F-fluoro-2-deossiglucosio (18F-FDG) (Tabella 1). L’immagine della scansione PET è un colorato che mostra le aree più attive dell’organo o del tessuto, a seconda della quantità di radiotraccianti che ha assorbito (Figura 27).5,68-70