Antisense Oligonucleotides Targeted to SMN2
ASOs sono acidi nucleici a singolo filamento sintetizzati per essere complementari a una sequenza di RNA target. Una volta somministrato, l’ASO viene assorbito nella cellula attraverso un meccanismo endocitico ancora poco definito e poi entra nel nucleo dove si lega al suo pre-mRNA bersaglio.62 Inizialmente, gli ASO sono stati utilizzati per sopprimere l’espressione genica bloccando la traduzione di un RNA bersaglio o promuovendo la sua degradazione. Oggi, gli ASO possono anche essere progettati per alterare l’elaborazione o lo splicing di un bersaglio. Gli ASO terapeutici SMA sono progettati per modificare lo splicing alterativo del pre-mRNA SMN2 in modo che l’esone 7 sia incluso nel trascritto finale elaborato. Come discusso nei capitoli precedenti, SMN2 differisce da SMN1 per una transizione C-to-T che avviene sei nucleotidi nell’esone 7 (ci sono altre differenze tra le due sequenze, ma questa è la più importante a livello funzionale). La transizione C-to-T crea un esteso contesto inibitorio nell’esone 7 (noto anche come “Exinct”).63 Poiché l’esone 7 è altrimenti debolmente definito a causa di un debole sito di splicing 5′, la mutazione C-to-T in SMN2 è sufficiente a far pendere la bilancia dalla sua inclusione all’esclusione.
Gli elementi di regolazione dello splicing giocano un ruolo importante nel determinare quali siti sono riconosciuti dal macchinario di splicing cellulare. La posizione e la funzione degli elementi SMN2 rilevanti sono stati identificati dall’analisi dell’effetto di splicing di un’ampia serie di ASO progettati per integrare la sequenza SMN2 in modo progressivamente iterativo.63-Il silenziatore di splicing intronico ISS-N1 è stato identificato come un elemento di silenziamento molto potente attraverso questo metodo; il motivo si trova a valle del sito di splicing 5′ dell’esone 7 e si lega al repressore di splicing hnRNP A1.66-68 Gli ASO sono stati progettati per indurre in modo affidabile l’inclusione dell’esone 7 puntando ISS-N1 o altri elementi regolatori.
Gli ASO possono essere progettati per essere bifunzionali. Per esempio, ASO chimerici che fondono i domini di reclutamento SR (peptide RS) con una sequenza antisenso che sopprime i motivi silenziatori hanno dimostrato di aumentare l’inclusione dell’esone 7 e i livelli di proteina SMN nei fibroblasti dei pazienti; una singola iniezione dell’ASO bifunzionale è stata in grado di indurre la proteina SMN nel cervello di topi neonatali e ha provocato un’estensione della durata della vita.65,69 Questa strategia di progettazione ASO, nota come ESSENCE (miglioramento dello splicing esone-specifico mediante piccoli effettori chimerici), è stata inizialmente perseguita nella terapia della SMA, ma studi successivi hanno dimostrato che il peptide RS non era necessario per ottenere un effetto robusto sull’inclusione dell’esone 7 SMN2. Poiché un approccio chimerico introduce difficoltà nella produzione dell’ASO e ne limita la permeabilità cellulare, gli ASO bifunzionali non sono stati testati estensivamente nei topi e non sono attualmente in fase di sviluppo clinico.62
Una volta che gli ASO diretti all’ISS-N1 hanno dimostrato di essere notevolmente efficaci nel promuovere l’inclusione dell’esone 7, la successiva questione strategica è stata quella di identificare quale struttura ASO sarebbe stata meglio utilizzata in una potenziale terapia SMA. Gli oligonucleotidi che compongono un ASO sono tipicamente modificati per ottimizzare le proprietà farmaceutiche come l’assorbimento cellulare, la tossicologia, la farmacocinetica e il legame con il target. Un adattamento comune, che è venuto fuori da una collaborazione tra Ciba-Geigy Ltd. (ora conosciuta come Novartis) e Ciba-Geigy Ltd. (ora conosciuta come Novartis). (ora nota come Novartis) e Isis Pharmaceuticals (ora nota come Ionis Pharmaceuticals), è il 2′-O-metossietilico (2′-MOE), che aumenta sia la resistenza dell’ASO alla degradazione delle nucleasi che l’affinità di ibridazione.70 Gli oligonucleotidi 2′-MOE hanno dimostrato di essere molto sicuri nei roditori e nei primati, compresi gli esseri umani.62 La somministrazione di un 2′-MOE ASO che blocca ISS-N1 ha aumentato con successo l’esone 7 di SMN2 in modo dose- e tempo-dipendente nei topi SMA, migliorando la patologia neuromuscolare e aumentando notevolmente la sopravvivenza.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals, in collaborazione con Biogen, sta sviluppando una terapia 2′-MOE ASO chiamata nusinersen (conosciuta anche come IONIS-SMNRx e precedentemente chiamata ISIS-SMNRx). Gli studi preclinici di nusinersen nei primati non umani hanno dimostrato che una singola iniezione intratecale potrebbe portare alle concentrazioni di tessuto necessarie per miglioramenti significativi nell’inclusione dell’esone 7 e che tali concentrazioni sono state mantenute per diversi mesi.62 La lunga emivita del farmaco significa che i pazienti potrebbero aver bisogno di un’iniezione intratecale solo ogni pochi mesi.73 In uno studio di fase 1 in aperto su pazienti SMA di tipo II/III di età compresa tra i 2 e i 14 anni, una singola iniezione di nusinersen è stata ben tollerata e sembra essere correlata a un aumento dei punteggi HFMSE al dosaggio più alto.74 Nel giugno 2015, Ionis ha rilasciato nuovi dati da uno studio di fase 2 in aperto di nusinersen nei neonati di tipo I, che ha mostrato che i neonati hanno vissuto più a lungo e hanno raggiunto più tappe motorie di quanto ci si aspetterebbe normalmente dalla storia naturale della malattia.75 Inoltre, il meccanismo d’azione del farmaco è stato supportato da dati che mostrano un aumento della quantità di mRNA SMN2 full-length e della proteina SMN nei tessuti del cervello e del midollo spinale dalle autopsie dei pazienti che hanno ricevuto il trattamento. Ionis ha anche pubblicato i dati dello studio di estensione in aperto di fase 2 in bambini con SMA di tipo II/III, mostrando che il 57% dei soggetti ha ottenuto un miglioramento di almeno tre punti nell’HFMSE e un miglioramento medio di 55 m nel 6-Minute Walk Test (6MWT).76 Studi di fase 3 di nusinersen sono attualmente in corso sia nei neonati che negli adulti con SMA (NCT02193074; NCT02292537); i risultati dovrebbero essere disponibili nel 2017.
Anche se non sono stati ancora osservati problemi di sicurezza con l’uso di 2′-MOE nella terapia della SMA, alcune tossicità sono state associate con 2′-MOE ASO in altre popolazioni di pazienti.77,78 Un’altra modifica della spina dorsale che si sta esplorando per l’uso nella SMA e che potrebbe aggirare questi problemi sono gli oligomeri di morfolino fosforamidato (PMO). I PMO hanno dimostrato di essere più efficaci del 2′-MOE in modelli murini di distrofia muscolare di Duchenne (DMD), un’altra malattia neuromuscolare pediatrica, e sono stati anche ben tollerati nei pazienti DMD.79 Un’iniezione ICV di morfolino ASO complementare a ISS-N1 ha migliorato significativamente la sopravvivenza dei topi SMA senza segni di tossicità del sistema nervoso centrale (CNS).80,81 Un morfolino mirato a ISS-E1, un silenziatore intronico di splicing che si trova a monte dell’esone 7, migliora anche il fenotipo dei topi SMA.82 Questo approccio non è stato ancora portato in clinica.
La chimica del backbone di un ASO può influenzare l’idoneità per vari metodi di somministrazione, la necessità di ripetere il dosaggio, e conferire tossicità associate – tutte cose che hanno importanti implicazioni per il suo uso terapeutico. Inoltre, un ASO usato per trattare la SMA deve rimanere farmacologicamente attivo nei tessuti del SNC, in particolare nei motoneuroni. Indipendentemente dalla struttura, qualsiasi ASO progettato per la terapia della SMA avrà probabilmente bisogno di essere somministrato direttamente nel liquido cerebrospinale tramite iniezione intratecale. Anche se alcuni studi che utilizzano la somministrazione periferica di ASO in topi neonatali hanno mostrato efficacia, la barriera emato-encefalica non è completamente formata nei topi giovani e un ASO somministrato perifericamente è in grado di penetrare nel SNC ad un livello che non è possibile nell’uomo.71 È incoraggiante notare che gli ASO iniettati per via intratecale hanno dimostrato di distribuirsi ampiamente tra importanti tessuti del SNC come i motoneuroni, gli astrociti e la microglia.72,83-Sebbene l’iniezione intratecale sia alquanto invasiva e richieda sedazione o anestesia, gli ASO presentano diversi vantaggi significativi rispetto ad altre modalità sperimentali, tra cui un’elevata specificità del bersaglio, una notevole efficacia, poca tossicità rispetto alla somministrazione sistemica di ASO e processi di produzione relativamente semplici rispetto ai biologici (ma non alle piccole molecole). Maggiori informazioni si trovano nel capitolo 18.
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