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Requisiti del campione e procedura

Gli ELISA vengono eseguiti in piastre di polistirene, tipicamente in piastre da 96 pozzetti rivestite per legare molto fortemente le proteine. A seconda del tipo di ELISA, il test richiede un anticorpo di rilevamento primario e/o secondario, analita/antigene, anticorpo/antigene di rivestimento, tampone, lavaggio e substrato/cromogeno. L’anticorpo di rilevazione primario è un anticorpo specifico che si lega solo alla proteina di interesse, mentre un anticorpo di rilevazione secondario è un secondo anticorpo coniugato all’enzima che lega un anticorpo primario che non è coniugato all’enzima.

Ci sono quattro fasi generali principali per completare un test immunologico ELISA. Queste fasi sono:

1. Coating (con antigene o anticorpo)
2. Blocking (tipicamente con l’aggiunta di albumina di siero bovino)
3. Rilevazione
4. Lettura finale

La rilevazione viene effettuata tramite l’aggiunta di un substrato che può generare un colore. Ci sono molti substrati disponibili per l’uso nella rilevazione ELISA. Tuttavia, i più comunemente usati sono la perossidasi di rafano (HRP) e la fosfatasi alcalina (ALP). Il substrato per la HRP è il perossido di idrogeno e produce un cambiamento di colore blu. L’ALP misura il colore giallo del nitrofenolo dopo periodi di incubazione a temperatura ambiente da 15 a 30 minuti e di solito usa il P-Nitrofenil-fosfato (pNPP) come substrato.

Tra ciascuna delle quattro fasi di cui sopra c’è un “lavaggio” della piastra usando un tampone, come la fosfato-salina tamponata (PBS) e un detergente non ionico, per rimuovere il materiale non legato. I pozzetti vengono lavati due o più volte durante ogni fase di lavaggio, a seconda del protocollo specifico seguito.

Nel protocollo ELISA, di solito, una diluizione seriale di concentrazioni viene posta nei pozzetti della piastra. Dopo che i risultati sono stati misurati, viene tracciata una curva standard dai dati delle diluizioni seriali con una concentrazione sull’asse x utilizzando una scala logica e l’assorbanza sull’asse y utilizzando una scala lineare.

Ci sono quattro tipi principali di ELISA:

• Diretto ELISA (piastra rivestita di antigene; anticorpo di screening)
• Indiretto ELISA (piastra rivestita di antigene; antigene/anticorpo di screening)
• Sandwich ELISA (piastra rivestita di anticorpo; screening antigene)

• Elisa competitivo (screening anticorpo)

  Elisa diretto

  L’ELISA diretto e quello indiretto iniziano con il rivestimento di antigene sulle piastre ELISA. La prima fase di legame comporta l’aggiunta di antigene alle piastre, che vengono incubate per un’ora a 37 gradi C o possono essere incubate a 4 gradi C durante la notte. Una volta che la fase di incubazione è completata, il passo successivo è quello di lavare le piastre di qualsiasi potenziale anticorpo non legato e bloccare qualsiasi sito non legato sulla piastra ELISA utilizzando agenti come BSA, ovalbumina, aprotinina, o altre proteine animali. Questo secondo passo è importante perché impedisce il legame di qualsiasi anticorpo non specifico alla piastra e riduce al minimo i risultati falsi positivi. Dopo aver aggiunto il tampone, la piastra viene lavata nuovamente e viene aggiunto un anticorpo di rilevamento primario selezionato coniugato con un enzima. La piastra viene ulteriormente incubata per un’ora.

  In un ELISA diretto, l’anticorpo primario di rilevazione si lega direttamente alla proteina di interesse. Successivamente, la piastra viene lavata nuovamente per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato e seguita dall’aggiunta di un substrato/cromoforo, come la fosfatasi alcalina (AP) o la perossidasi di rafano (HRP) alla piastra, che provoca un cambiamento di colore. Il cambiamento di colore del campione avviene tramite l’idrolisi dei gruppi fosfato dal substrato da parte della AP o tramite l’ossidazione dei substrati da parte della HRP. I vantaggi dell’uso dell’ELISA diretto includono l’eliminazione della reattività incrociata dell’anticorpo secondario e, grazie al minor numero di passaggi, è rapido rispetto all’ELISA indiretto. I suoi svantaggi includono la sua bassa sensibilità rispetto agli altri tipi di ELISA e il suo alto costo di reazione.

  Elisa indiretto

  Le fasi dell’ELISA indiretto sono identiche all’ELISA diretto, ad eccezione di un ulteriore passaggio di lavaggio e dei tipi di anticorpi aggiunti dopo la rimozione del tampone. L’ELISA indiretto richiede due anticorpi, un anticorpo primario di rilevazione che si attacca alla proteina di interesse e un anticorpo secondario legato ad un enzima complementare all’anticorpo primario. L’anticorpo primario viene aggiunto per primo, seguito da una fase di lavaggio, e poi l’anticorpo secondario coniugato all’enzima viene aggiunto e incubato. Dopo questo, le fasi sono le stesse dell’ELISA diretto, che comprende una fase di lavaggio, l’aggiunta del substrato e la rilevazione di un cambiamento di colore.

  L’ELISA indiretto ha una sensibilità più elevata rispetto all’ELISA diretto. È anche meno costoso e più flessibile grazie ai molti possibili anticorpi primari che possono essere utilizzati. L’unico grande svantaggio di questo tipo di ELISA è il rischio di reattività incrociata tra gli anticorpi secondari di rilevazione.

  Sandwich ELISA

  A differenza dell’ELISA diretto e indiretto, l’ELISA a sandwich inizia con un anticorpo di cattura rivestito sui pozzetti della piastra. Viene chiamato “sandwich” perché gli antigeni sono inseriti tra due strati di anticorpi (anticorpi di cattura e di rilevazione). Dopo aver aggiunto l’anticorpo di cattura alle piastre, queste vengono coperte e incubate per una notte a 4°C. Una volta completata la fase di rivestimento, le piastre vengono lavate con PBS, quindi tamponate/bloccate con BSA. I lavaggi con il buffer vengono eseguiti per almeno 1-2 ore a temperatura ambiente. Infine, la piastra viene lavata con PBS ancora una volta prima dell’aggiunta dell’antigene.

  L’antigene di interesse viene quindi aggiunto alle piastre per legarsi all’anticorpo di cattura e incubato per 90 minuti a 37 gradi C. La piastra viene nuovamente lavata, e l’anticorpo primario di rilevamento viene quindi aggiunto alla piastra e incubato per altre 1 o 2 ore a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con tampone. Poi viene aggiunto l’anticorpo secondario coniugato con un enzima e incubato per altre 1 o 2 ore. La piastra viene nuovamente lavata e il substrato viene aggiunto per produrre un cambiamento di colore. L’ELISA a sandwich ha la più alta sensibilità tra tutti i tipi di ELISA. I maggiori svantaggi di questo tipo di ELISA sono il tempo e la spesa e l’uso necessario di “matched pair” (antigene divalente/multivalente) e di anticorpi secondari.

  Elisa competitivo

  L’ELISA competitivo verifica la presenza di un anticorpo specifico per gli antigeni nel siero in esame. Questo tipo di ELISA utilizza due anticorpi specifici, un anticorpo coniugato con un enzima e un altro anticorpo presente nel siero in esame (se il siero è positivo). Combinando i due anticorpi nei pozzetti si crea una competizione per il legame con l’antigene. La presenza di un cambiamento di colore significa che il test è negativo perché l’anticorpo coniugato all’enzima ha legato gli antigeni (non gli anticorpi del siero in esame). L’assenza di colore indica un test positivo e la presenza di anticorpi nel siero in esame. L’ELISA competitivo ha una bassa specificità e non può essere utilizzato in campioni diluiti. Tuttavia, i vantaggi sono che c’è meno purificazione del campione necessario, può misurare una vasta gamma di antigeni in un dato campione, può essere utilizzato per piccoli antigeni, e ha bassa variabilità.