Bulk RNA-seq Data Standards and Processing Pipeline

Panoramica della pipeline

La Bulk RNA-seq pipeline è stata sviluppata come parte della serie ENCODE Uniform Processing Pipelines. Il codice completo della pipeline è liberamente disponibile su Github e può essere eseguito su DNAnexus (il link richiede la creazione di un account) al loro prezzo attuale.

La pipeline ENCODE Bulk RNA-seq può essere utilizzata sia per le librerie RNA-seq replicate e non replicate, paired-ended o single-ended, e strand-specific o non strand-specific. Le librerie devono essere generati da mRNA (poly (A) +, rRNA-depleted RNA totale, o poly (A) – popolazioni che sono dimensioni-selezionati per essere più lungo di circa 200 bp. In futuro, questa pipeline può anche essere utilizzata per elaborare i dati PAS-seq e Bru-seq.

Schema della pipeline per dati appaiati

Vedi l’istanza corrente di questa pipeline per dati appaiati

Schema della pipeline per dati single-ended

Vedi le istanze correnti di questa pipeline per dati single-ended

Input:

Formato del file	Informazioni contenute nel file	File descrizione	Note
fastq	leggi	G-Letture di RNA-seq in blocco zippate	Le letture devono soddisfare i criteri delineati nelle Restrizioni della pipeline di elaborazione uniforme.
tar	indice del genoma	Generato da STAR o TopHat	Per favore vedi il paragrafo intitolato “Riguardo l’allineamento e la quantificazione” sotto la tabella “Outputs” per maggiori informazioni sugli allineatori e i loro indici.
fasta	sequenza spike-in	ERCC Spike-ins (External RNA Control Consortium)	Gli spike-ins sono effettivamente i controlli dell’esperimento RNA-seq.

Output:

Formato del file	Informazioni contenute nel file	Descrizione del file	Note
bam	allineamenti	Prodotti dalla mappatura delle letture al genoma.	Si prega di vedere il paragrafo intitolato “Per quanto riguarda l’allineamento e la quantificazione” sotto la tabella “Outputs” per ulteriori informazioni sugli allineatori e i loro indici.
bam	allineamenti del trascrittoma	Prodotti dalla mappatura delle letture al trascrittoma.
bigWig	segnale	Segnale normalizzato RNA-seq	Per i dati a filamento, i segnali sono generati per le letture uniche e le letture uniche+multimappatura in entrambi i filamenti positivo e negativo. Per i dati non filiformi, i segnali sono generati per le letture uniche e le letture uniche+multimappatura senza considerare l’identità del filamento.
tsv	quantificazioni geniche	Include le quantificazioni spike-ins	Le specifiche del formato del file sono le seguenti: colonna 1: gene_id colonna 2: transcript_id(s) colonna 3: lunghezza colonna 4: effective_length colonna 5: expected_count colonna 6: TPM (transcripts per million) colonna 7: FPKM (fragments per kilobase of transcript per million) colonna 8: posterior_mean_count colonna 9: posterior_standard_deviation_of_count colonna 10: pme_TPM colonna 11: pme_FPKM colonna 12: TPM_ci_lower_bound colonna 13: TPM_ci_upper_bound colonna 14: FPKM_ci_lower_bound colonna 15: FPKM_ci_upper_bound
tsv	quantificazioni di trascrizione	Include le quantificazioni degli spike-in	Si prega di vedere l’avvertimento riguardante le quantificazioni di trascrizione nel paragrafo sottostante intitolato “Regarding alignment and quantification”.
La pipeline produce anche metriche di qualità, tra cui la correlazione Spearman e la profondità di lettura.

Per quanto riguarda l’allineamento e la quantificazione:

La mappatura delle letture è fatta usando il programma STAR (in alcuni casi, entrambi gli allineatori STAR e TopHat sono usati per produrre file bam separati) e la quantificazione di geni e trascrizioni è fatta con il programma RSEM. Sebbene ci sia un accordo generale tra le mappature e le quantificazioni dei geni prodotte da diverse pipeline di RNA-seq, le quantificazioni delle singole isoforme di trascrizione, essendo molto più complesse, possono differire sostanzialmente a seconda della pipeline di elaborazione impiegata e sono di precisione sconosciuta. Pertanto, gli allineamenti e le quantificazioni dei geni possono essere usati con fiducia, mentre le quantificazioni dei trascritti dovrebbero essere usate con cautela.

Riferimenti genomici

Vedi i riferimenti del genoma e le dimensioni dei cromosomi usati in questa pipeline

Queste pipeline richiedono sia informazioni di assemblaggio per le specie di interesse che un riferimento genico. Ognuno dei programmi principali, TopHat, STAR e RSEM crea un indice da usare nei passi successivi. Maggiori informazioni sull’uso di RSEM sono disponibili qui.

Controlli spike-in di RNA esogeno

I controlli spike-in di RNA esogeno vengono aggiunti ai campioni per creare una linea di base standard per la quantificazione dell’espressione di RNA (PMC3166838). Il consorzio ENCODE si sta standardizzando sull’uso dell’Ambion Mix 1 commercialmente disponibile spike-in ad una diluizione di ~2% delle letture finali mappate. Tuttavia, c’è una miscela di dati più vecchi e di dati importati. Pertanto, per tenere traccia degli spike-in utilizzati in una determinata libreria, esiste un set di dati associato alla libreria. Quel dataset conterrà il file di sequenza degli spike-in in formato fasta e le informazioni sulle concentrazioni. Ci si aspetta che queste sequenze spike-in si trovino nell’indice del genoma utilizzato nella fase o nelle fasi di mappatura e nel bam generato successivamente. Le quantificazioni delle sequenze si trovano nei file di trascrizione e quantificazione dei geni RSEM.

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Links e pubblicazioni

Trova i dati generati da questa pipeline: Tutti | solo paired-end | solo single-end
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