La conversione enzimatica di mRNA in DNA a doppio filamento può essere realizzata con una serie di procedure diverse. Tutte implicano l’azione della trascrittasi inversa e la sintesi di cDNA con oligonucleotidi. Dopo di che, le procedure di uso comune divergono considerevolmente. Ci sono un certo numero di metodi per sintetizzare il secondo filamento e diverse procedure per produrre estremità adatte a rendere il DNA clonabile. Gli obiettivi principali di queste procedure sono di costruire un DNA inserto che sia il più lungo possibile, con un alto rendimento di conversione dell’mRNA in DNA che possa legarsi al DNA vettore. I seguenti protocolli richiedono solo reagenti disponibili in commercio e di solito hanno successo nella produzione di buone librerie di cDNA. Il protocollo di base descrive un metodo per fare cDNA blunt-ended che può poi essere legato a linker per la successiva clonazione in un sito di restrizione unico come EcoRI. Il protocollo alternativo è una variazione che richiede meno manipolazioni enzimatiche e permette la costruzione di librerie di cDNA direzionali, che sono particolarmente desiderabili quando l’obiettivo è quello di generare librerie di cDNA di espressione. Il protocollo alternativo si avvale di un linker-primer costituito da (in ordine da 3 ‘a 5′) un primer oligo (dT), un sito di restrizione per l’endonucleasi XhoI, e un (GA) 20 ripetere per proteggere il sito di restrizione durante la generazione del cDNA blunt-ended. I siti interni XhoI sulle singole molecole di cDNA sono protetti dall’incorporazione di 5-metil-dCTP nel mix di nucleotidi del primo filamento. I cDNA risultanti con estremità uniche possono essere clonati in vettori EcoRI /XhoI -digestiti dopo la legatura di adattatori EcoRI all’estremità 5′ e la digestione da XhoI per rilasciare i siti 3’ XhoI che sono stati incorporati nel cDNA dal linker-primer. Queste modifiche si traducono in una procedura notevolmente semplificata che è sostanzialmente più veloce e più facile che il protocollo di base.