Elucidare il ruolo funzionale di Mycobacterium smegmatis recX nella risposta allo stress

L’ipossia causa un aumento dell’espressione dei geni recA e recX di M. smegmatis recA e recX

Durante il corso dell’infezione e della proliferazione, M. tuberculosis è esposto a condizioni fisiologiche di stress come l’ipossia e lo stress da pH acido, che potrebbero compromettere la sua sopravvivenza38,39,40. Per esempio, lo stress ipossico acuto arresta la replicazione del DNA e innesca un robusto danno al DNA41,42,43. Un aumento dell’espressione dei geni della via SOS, tra cui umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB e uvrD, inizia con il danno al DNA44,45,46. A tal fine, i profili di espressione genica indotti dall’ipossia in M. smegmatis e M. tuberculosis durante l’infezione latente hanno fornito informazioni preziose sulla natura dei bacilli tubercolari latenti e sul loro trattamento47.

Studi precedenti in M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 e Streptomyces lividans50 hanno dimostrato che recA è co-trascritto con recX. Inoltre, una sovraespressione di RecA (un regolatore positivo della risposta SOS) è risultata essere tossica in assenza di RecX in alcune specie batteriche tra cui Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 e Xanthomonas oryzae53. Questi risultati sono coerenti con la nozione che RecX agisce come un anti-ricombinatore per sedare gli eventi di ricombinazione inappropriati promossi da RecA14. Al contrario, una sovraespressione di RecA nel ceppo E. coli ΔrecX non è deleteria e la delezione di recX non influenza l’espressione recA54. La trascrizione di recX in E. coli è downregolata rispetto a recA in condizioni di crescita normali a causa dell’esistenza di un sito di terminazione della trascrizione tra le sequenze codificanti di recA e recX. Tuttavia, un recA-recX mRNA trascrizione risultante da trascrizione read-through si accumula nel range di 5-10% del contenuto totale recA mRNA54. La trascrizione recX era difficilmente rilevabile durante la crescita vegetativa di E. coli, ma robusta espressione di recX si verifica dopo il trattamento con agenti dannosi per il DNA15,55.

I genomi di entrambi M. smegmatis e M. tuberculosis contengono una singola copia ciascuno di recA e recX in un singolo operone. Per studiare l’espressione e la regolazione di questi geni in condizioni di crescita aerobica e ipossica in M. smegmatis, un modello surrogato comunemente usato per M. tuberculosis, l’abbondanza relativa di mRNA in varie fasi di crescita è stata misurata da un saggio RT-qPCR e normalizzata a quella del gene 16S rRNA costitutivamente espresso. I valori di soglia del ciclo (Ct) per M. smegmatis recA e recX mRNA sono stati normalizzati rispetto al valore Ct del gene16S rRNA. In contrasto con E. coli15,55, una quantità significativa di recA trascrizioni mRNA sono stati visti in fase iniziale-log sia in condizioni di cultura aerobica e ipossica (Fig. 1A). È interessante notare che le condizioni ipossiche migliorato l’accumulo di recA mRNA di 1,5 volte a metà della fase log, e diminuito in seguito come le cellule sono entrate nella fase stazionaria. Un modello simile è stato osservato con l’abbondanza di mRNA recX sia in condizioni aerobiche che ipossiche, anche se a livelli ridotti (Fig. 1B). Queste osservazioni supportano l’idea che i due geni sono co-trascritti e coordinatamente regolati in condizioni di crescita aerobica e ipossica. Intrigante, nessuna differenza è stata vista nelle quantità di mRNA in condizioni di crescita aerobica e ipossica nella fase iniziale-log. I profili trascrizionali dei geni marcatori specifici della fase di crescita di M. smegmatis (sigH2 e sigH7)56 sono stati utilizzati per accertare i tempi delle fasi early-log, mid-log e stazionaria (Fig. 1C). Nei ceppi clinici multiresistenti di M. tuberculosis, i livelli di mRNA di recA e recX sono risultati più alti che nei ceppi sensibili ai farmaci e i livelli di mRNA di recX sono aumentati in concomitanza con un aumento di mRNA di recA57.

Tuttavia, va notato che i livelli di mRNA non possono essere usati come surrogati dei corrispondenti livelli di proteine. Pertanto, l’abbondanza delle proteine RecA e RecX in M. smegmatis è stata misurata in condizioni aerobiche e ipossiche mediante un test Western blot utilizzando anticorpi anti-RecA e anti-RecX. GroEL è stato analizzato come controllo di carico delle proteine. L’analisi densitometrica degli immunoblot ha rivelato che le cellule hanno accumulato livelli più elevati di RecA in condizioni di crescita ipossica rispetto alle condizioni aerobiche (Fig. 2A,B). Un’analisi comparativa ha mostrato che le cellule costantemente accumulato 2 volte più alti livelli di RecA a metà-log fasi rispetto alla fase iniziale-log in condizioni di crescita aerobica, che è diminuita alla fase stazionaria ai livelli visti alla fase iniziale-log (Fig. 2A,B). Un modello simile è stato osservato per RecX, anche se i livelli erano meno pronunciati di quelli di RecA (Fig. 2A,C). Anche se i modelli di espressione dell’mRNA e della proteina erano comparabili, sono state notate importanti differenze. In primo luogo, la proteina RecX era difficilmente rilevabile in fase iniziale-log durante le condizioni di ipossia. In secondo luogo, l’abbondanza di RecA mRNA e la proteina erano più alti rispetto a RecX.

Anche se, questi risultati suggeriscono che M. smegmatis recA e recX geni sono indotti in condizioni ipossiche, non vi è alcuna correlazione tra la quantità di recX mRNA e proteina corrispondente nella fase early-log. Sia M. tuberculosis che M. smegmatis hanno dimostrato di stabilizzare i loro trascritti di mRNA in condizioni di inibizione della crescita58,59,60. Tra i possibili meccanismi, è stato dimostrato che la riprogrammazione del tRNA e la traduzione selettiva dei codoni hanno un ruolo nei micobatteri in risposta all’ipossia61. Una possibile spiegazione per la mancanza di correlazione tra l’mRNA recX e il livello di proteina nella prima fase log potrebbe essere dovuta alla repressione traslazionale dell’mRNA recX.

Costruzione di ceppi mutanti ΔrecX e ΔrecA ΔrecX

La differenza nei livelli di proteine RecA e RecX in M. smegmatis indica una possibile regolazione dell’espressione genica a livello di trascrizione. In molti batteri studiati finora, il gene recX si trova sullo stesso filamento codificante a valle di recA e i due geni sono co-trascritti48,50,53,54,62,63. Tuttavia, nel locus lexA-recA-recX di Xanthomonas pathovars, ogni gene è espresso dal proprio promotore64. Inoltre, in D. radiodurans65,66, B. subtilis67 e N. gonorrhoeae26, i geni recA e recX sono separati da diverse centinaia di kb di lunghezza e trascritti dai propri promotori.

In un certo numero di specie micobatteriche, così come in pochi altri batteri, la regione 5′ della sequenza codificante recX si sovrappone alla regione 3′ del gene recA. La sovrapposizione è lunga 32 bp in M. smegmatis48, mentre in M. tuberculosis68 e M. leprae69 la sovrapposizione è 35 bp. L’effetto della delezione di recX sulle caratteristiche fenotipiche è stato studiato in vari organismi7,10. I mutanti knockout di recX mostrano una serie di fenotipi associati alle funzioni RecA: l’inattivazione di recX di B. subtilis ha reso le cellule sensibili a MMS e H2O225, i mutanti recX di S. lividans hanno mostrato una ridotta resistenza ai danni UV42 e il mutante recX di N. gonorrhoeae ha mostrato una piccola diminuzione della sua capacità di sopravvivere ai danni al DNA causati da rotture del doppio filamento26. Tuttavia, l’impatto della delezione di entrambi i geni recA e recX sulle caratteristiche di crescita e sulla riparazione dei danni al DNA non è stato studiato in nessun organismo. Inoltre, una piena comprensione del ruolo in vivo di recX nei micobatteri non è completamente compreso.

Studi precedenti hanno dimostrato che il ceppo M. smegmatis ΔrecA esposto sensibilità ai danni al DNA indotti da UV e non riesce a promuovere HR52. Abbiamo combinato la mutazione recA con la delezione di recX per studiare gli effetti delle doppie mutazioni. A questo scopo, M. smegmatis mc2155 ha generato ceppi mutanti recX singoli e doppi recArecX. Come controllo, l’effetto della delezione di recA in M. smegmatis è stato rivalutato per un confronto diretto. Utilizzando il metodo di ricombinazione, che si basa su un protocollo sviluppato per M. tuberculosis e M. bovis BCG28, il M. smegmatis mc2155 ΔrecA e ΔrecAΔrecX mutanti sono stati generati utilizzando 3,279 kb e 3,302 kb lineare ΔrecA::hyg e ΔrecAΔrecX::hyg AES costrutti, rispettivamente. Circa 100 ng di frammenti di DNA AES lineare sono stati generati dalla digestione di restrizione dei rispettivi plasmidi con EcoRV (Fig. 3A). Questi sono stati trasformati in competenti M. smegmatis mc2155:pJV53 cellule ricombinanti70. Dopo 4-5 giorni di incubazione, 8-10 colonie Hyg-resistente sono stati trovati per i mutanti ΔrecX e ΔrecAΔrecX. I ceppi mutanti putativi sono stati controllati utilizzando PCR per determinare se i geni recX e recArecX sono stati eliminati dal cromosoma (dati non mostrati). I mutanti corretti sono stati coltivati in 7H10 Middlebrook agar medium per 5-8 generazioni per permettere la perdita di pJV53.

Analisi genotipica e fenotipica di M. smegmatis ΔrecX e ΔrecAΔrecX mutanti

Dopo lo screening mediante PCR, sono stati ottenuti 2 mutanti knockout ΔrecX e ΔrecAΔrecX di M. smegmatis mc2155. I mutanti ΔrecX e ΔrecAΔrecX sono stati caratterizzati dalla mappatura degli enzimi di restrizione e dall’ibridazione Southern blot (Fig. 3). Dopo l’ibridazione con sonde radiomarcate appropriate, un frammento di 4,1 kb è stato visto nel caso delle cellule M. smegmatis mc2155 wild-type. I frammenti previsti di 3,14 kb e 2,09 kb sono stati osservati nei mutanti ΔrecX e ΔrecAΔrecX rispettivamente (Fig. 3B,C). Entrambe queste bande sono più piccole di 4,1 kb, indicando che i geni recX e recArecX sono stati eliminati per sostituzione allelica. La frequenza di scambio allelico rispetto a recX e recArecX era nell’intervallo del 70% e 80% rispettivamente.

Un avvertimento di questa analisi è che gli effetti osservati delle mutazioni ΔrecX e ΔrecAΔrecX potrebbero derivare dagli effetti polari dell’inserimento del gene di resistenza all’igromicina. In generale, le alterazioni genetiche intorno al locus recA-recX potrebbero portare a effetti polari sull’espressione dei geni a valle del locus recA-recX. Due esperimenti indipendenti sono stati condotti per indagare i potenziali effetti polari. In primo luogo, i mutanti ΔrecX e ΔrecAΔrecX sono stati integrati con le copie funzionali dei geni recA e recX. I trasformanti sono stati valutati per la loro capacità di crescere in un terreno di coltura standard e di proteggere le cellule mutanti dall’irradiazione UV. Diluizioni seriali di dieci volte sono state macchiate su piastre di agar 7H10 e analizzate. Come mostrato in Fig. 4A,B, il recA wild-type ha parzialmente completato i ceppi mutanti ΔrecA e ΔrecAΔrecX, come dedotto dalla loro capacità di sostenere la crescita e fornire protezione contro le radiazioni UV. Tuttavia, recX wild-type non è riuscito a salvare il fenotipo dei ceppi mutanti ΔrecAΔrecX osservato sull’induzione del danno al DNA con l’irradiazione UV. Dal momento che la delezione di recX non ha avuto alcun effetto visibile sulla crescita in condizioni normali e di danno al DNA, ΔrecX e il suo corrispondente ceppo complementare hanno mostrato una crescita simile a quella del wild-type.

In secondo luogo, abbiamo valutato l’espressione di due M. smegmatis mc2155 geni, gluD (MSMEG_2725) e glnH (MSMEG_2726), situati a valle del locus recA recX nei ceppi mutanti ΔrecA ΔrecX e ΔrecX rispetto al ceppo wild-type. Il gene M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) situato a monte del locus recA-recX è stato usato come controllo positivo. L’RNA totale è stato preparato dai ceppi wild-type, ΔrecA ΔrecX e ΔrecX mutante. Le abbondanze relative dei trascritti genici sono state determinate mediante RT-qPCR quantitativa e normalizzate a quelle del gene cromosomico 16S rRNA costitutivamente espresso. I livelli di espressione sono stati misurati da cellule cresciute nella tarda fase di crescita esponenziale. In tutti i casi, i profili di espressione genica di entrambe le ORF a monte e a valle erano simili per i ceppi wild-type e mutanti (Fig. 4C). Presi insieme, questi risultati escludono la possibilità che l’inserimento del gene di resistenza all’igromicina causi effetti polari.

I ceppi mutanti M. smegmatis ΔrecA e ΔrecA ΔrecX mostrano una crescita ridotta e una resa cellulare ridotta rispetto al ceppo wild-type

Per caratterizzare il M. smegmatis ΔrecX e ΔrecA ΔrecX mutante, i profili di crescita dei ceppi wild-type e knockout sono stati misurati in brodo Middlebrook 7H9 a 37 °C (Fig. 5). La delezione recX non ha avuto alcun effetto discernibile (rispetto al ceppo wild-type) sulla crescita di M. smegmatis. In condizioni simili, la delezione di recA ha aumentato notevolmente la lunghezza della fase di ritardo e concomitantemente ridotto la fase di crescita esponenziale, suggerendo che recA gioca un ruolo nella crescita e nella vitalità di M. smegmatis. Inoltre, questi risultati sono coerenti con la funzione nota di RecA nel salvataggio delle forchette di replicazione in stallo o collassate71,72,73. Poiché i geni recA e recX formano un singolo operone, l’impatto della loro delezione sulla crescita di M. smegmatis è stato studiato. Il ceppo knockout ΔrecA ΔrecX ha mostrato un fenotipo di crescita che era intermedio tra il mutante ΔrecA e il ceppo wild-type; tuttavia la crescita nelle fasi log tardiva e stazionaria era simile a quella dei ceppi ΔrecA e wild-type.

La delezione di recA, ma non di recX, rende M. smegmatis più suscettibile agli agenti dannosi per il DNA

Similmente ad altri eubatteri, la proteina micobatterica RecA gioca un ruolo cruciale nella regolazione della risposta SOS su danni al DNA74,75,76,77. Per verificare se l’assenza di recArecX e recX influenza la capacità di M. smegmatis di riparare efficacemente il DNA danneggiato, i mutanti sono stati esposti a una serie di agenti con vari meccanismi di danno al DNA. In questi esperimenti, lo stress è stato indotto esponendo i ceppi mutanti ΔrecA, ΔrecX e ΔrecA ΔrecX a radiazioni UV, MMS, H2O2 o ciprofloxacina durante la fase esponenziale (OD600 di 0,6) della crescita batterica. Dopo 3 ore di incubazione, le cellule sono state lavate e la loro vitalità è stata valutata macchiando diluizioni seriali di dieci volte delle colture su piastre di agar Middlebrook 7H10 contenenti igromicina (100 µg/ml). La concentrazione/dose più appropriata degli agenti dannosi per il DNA è stata determinata dopo aver valutato le differenze nella vitalità cellulare tra i ceppi utilizzando i saggi in piastra. In assenza di agenti dannosi per il DNA, tutti i ceppi hanno mostrato livelli simili di vitalità cellulare (Fig. 6). Al contrario, in presenza di agenti dannosi per il DNA, il ceppo ΔrecA ha mostrato un pronunciato difetto di crescita accompagnato da una diminuzione di 100 volte dell’efficienza di placcatura rispetto al ceppo wild-type. Questo fenotipo è coerente con la letteratura disponibile. Al contrario, l’effetto letale di UV, MMS o ciprofloxacina, ma non H2O2, è stato parzialmente bloccato dalla delezione del gene recX nel ceppo ΔrecA. Anche se la base per la mancanza di effetto H2O2 non è chiara, la concentrazione utilizzata probabilmente non era abbastanza alta da influenzare la crescita. È interessante notare che il ceppo ΔrecX ha mostrato un fenotipo leggermente più resistente contro tutti e quattro gli agenti dannosi per il DNA rispetto al ceppo ΔrecA ΔrecX, indicando un possibile guadagno di funzione dovuto alla perdita del gene recX. Dati questi risultati, è evidente che recA svolge un ruolo attivo nella risposta SOS e che la sensibilità agli agenti dannosi per il DNA è leggermente soppressa nel ceppo ΔrecX.

Sopravvivenza dopo il trattamento con diverse concentrazioni di agenti dannosi per il DNA

I micobatteri sperimentano una serie di condizioni di stress avverso, come stress ossidativo, nutrizionale e indotto da farmaci78,79,80,81,82. Per esplorare ulteriormente le differenze di vitalità cellulare, sono stati condotti esperimenti in cui la vitalità cellulare è stata misurata mediante unità formanti colonie (CFU). In primo luogo, la vitalità di M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX e ΔrecAΔrecX mutanti sono stati testati in confronto con quella del wild-type sfidandoli con concentrazioni crescenti di MMS. I ceppi sono stati coltivati in presenza di concentrazioni indicate di MMS, fino a quando le colture hanno raggiunto una OD600 di 0,6. La vitalità cellulare è stata valutata piastrando un numero predeterminato di cellule su piastre di agar 7H10. Le cellule sono state giudicate vive se erano in grado di dividersi e formare colonie. I mutanti, a differenza del ceppo wild-type, hanno mostrato una maggiore sensibilità al MMS in modo dipendente dalla concentrazione. L’analisi quantitativa ha indicato che il mutante ΔrecA ha mostrato una sensibilità relativamente più alta al MMS, che aumentava con l’aumentare delle concentrazioni di MMS (Fig. 7A). Nel caso di ΔrecX, le cellule erano ~ 2 volte meno sensibili a MMS rispetto alle cellule ΔrecA. D’altra parte, il mutante ΔrecA ΔrecX ha mostrato una maggiore sensibilità alla MMS rispetto al mutante ΔrecX. La sensibilità del mutante ΔrecX a MMS indica che recX potrebbe avere obiettivi ancora non identificati oltre a RecA. Questa ipotesi necessita di ulteriori indagini.

In seguito, le sensibilità del M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX e ΔrecA ΔrecX mutanti rispetto al ceppo wild-type sono stati determinati esponendoli a concentrazioni crescenti di H2O2. I risultati mostrano che il mutante ΔrecA era meno sensibile a questo trattamento (Fig. 7B). La delezione di recX da sola, o la delezione del locus recA-recX, ha avuto solo un effetto minore sulla vitalità e proliferazione delle cellule mutanti in risposta al trattamento H2O2. In particolare, i ceppi mutanti ΔrecA e ΔrecAΔrecX hanno esibito un fenotipo di crescita sensibile all’irradiazione UV e alla ciprofloxacina che è significativamente molto più grave rispetto a MMS o H2O2 (Fig. 7C,D). Inoltre, il ceppo ΔrecA ha mostrato una maggiore sensibilità all’irradiazione UV e alla ciprofloxacina rispetto al ceppo mutante doppio ΔrecA ΔrecX.

L’espressione dei geni recA e recX sono indotti dal danno al DNA

Gli elementi regolatori a monte del gene recA non sono conservati in tutte le specie micobatteriche. Per esempio, il gene recA di M. tuberculosis è trascritto da due promotori: entrambi sono indotti dal danno al DNA, anche se attraverso meccanismi diversi. Il promotore P1 di M. tuberculosis recA (prossimale al codone di inizio) può essere indotto dopo un danno al DNA indipendentemente dalle proteine LexA e RecA. Al contrario, il promotore P2 (situato lontano dal codone di inizio di recA) è regolato da LexA, che è funzionalmente analogo al promotore recA di E. coli83,84,85. È interessante notare che il meccanismo di induzione del danno al DNA in M. tuberculosis non è completamente conservato in M. smegmatis46,75. Questi risultati sottolineano la necessità di comprendere l’espressione e la regolazione dei geni recA e recX di M. smegmatis e i loro ruoli in risposta agli agenti dannosi per il DNA. Come descritto sopra, l’ipossia ha causato un aumento dell’espressione dei geni recA e recX di M. smegmatis (Fig. 1). Per corroborare ulteriormente la nozione che l’espressione dei geni recA e recX di M. smegmatis è danneggiabile, la cinetica dell’induzione con e senza danno al DNA è stata determinata usando RT-qPCR. Campioni di RNA totale sono stati preparati da cellule di M. smegmatis raccolte a 0, 3, 6, 9 e 12 ore dopo l’esposizione alla luce UV e da culture non trattate e analizzate come descritto nella sezione Metodi. I risultati non hanno rivelato differenze significative tra i livelli di trascrizione recA e recX nelle cellule non trattate. Al contrario, un marcato aumento dei trascritti mRNA di recA e recX è stato osservato 3 ore dopo l’esposizione ai raggi UV, per poi diminuire leggermente in seguito. Un confronto dei dati RT-qPCR indica importanti differenze tra i livelli di trascrizione di recA e recX. L’esposizione alle radiazioni UV ha portato ad un aumento di ~ 8 volte in recA mRNA rispetto al controllo, mentre recX da ~ 3 volte (Fig. 8A,B). Quindi, anche se recA e recX mRNA esistono nella stessa unità trascrizionale, questi risultati supportano l’idea che la produzione e/o la stabilità del trascritto recX mRNA è soggetto ad un ulteriore meccanismo di regolazione post-trascrizionale.

Questi risultati ci hanno portato ad eseguire ulteriori esperimenti per determinare la cinetica di accumulo delle proteine RecA e RecX in cellule M. smegmatis con o senza danni al DNA. I saggi di Western blotting sono stati eseguiti su lisati di cellule intere utilizzando anticorpi policlonali sollevati contro RecA e RecX (Fig. 8C). La quantificazione dei Western blot ha mostrato che le cellule contenevano quantità significative di entrambe le proteine RecA e RecX in cellule non indotte (Fig. 8D,E). Per confronto, un aumento di 2 volte l’abbondanza di entrambi RecA e RecX (rispetto al controllo) è stato visto in cellule 3 ore dopo l’esposizione ai raggi UV e diminuito in seguito. È importante notare che l’induzione delle proteine RecA e RecX ha mostrato un modello che ricorda quello visto nelle cellule in condizioni di ipossia (Fig. 2), anche se i meccanismi con cui danneggiano il DNA sono probabilmente diversi.

Concludendo osservazioni

Numerosi studi hanno dimostrato che recA e recX eseguire una vasta gamma di funzioni relative alla riparazione del DNA e ricombinazione7,10. A nostra conoscenza, gli stimoli che attivano l’espressione dei geni recA e recX di M. smegmatis non sono stati identificati. In questo studio, i livelli di espressione di questi geni sono stati valutati in cellule in crescita aerobica e in risposta a varie condizioni di stress. In M. smegmatis, simile a molte specie batteriche, recA e recX appartengono allo stesso operone, e il gene recX è situato immediatamente a valle del gene recA, e condividono regioni di codifica sovrapposte86. È stato trovato che gli agenti dannosi per il DNA hanno indotto l’espressione di entrambi i geni in misura diversa; tuttavia, i rapporti di espressione seguono un modello simile. È interessante notare che i livelli di RecA e RecX rimangono elevati in condizioni di stress rispetto alle condizioni di crescita aerobica.

Diversi studi hanno dimostrato ruoli alternativi per recX nella riparazione del DNA ricombinante promossa da RecA. Mentre la proteina RecX interagisce fisicamente con RecA e funziona come un potente inibitore di tutte le funzioni note di quest’ultimo in molte specie batteriche14,46,48, potenzia la ricombinazione omologa in N. gonorrhoeae e B. subtilis25,26. Per ottenere approfondimenti sul ruolo di recX nella risposta allo stress in micobatteri, mutanti knockout di M. smegmatis recX e recArecX sono stati costruiti. È interessante notare che la delezione di recX in M. smegmatis ha prodotto un fenotipo leggermente più resistente contro tutti e quattro gli agenti dannosi per il DNA, indicando un possibile guadagno di funzione dovuto alla perdita del gene recX. La base molecolare di questo effetto non è chiara, che sembra utile da esplorare in studi futuri. Mentre la nostra analisi si è concentrata principalmente sull’interazione genetica tra recA e recX nel percorso di riparazione del DNA ricombinante, è interessante notare che recX sembra svolgere un ruolo importante nella crescita batterica. In sintesi, questi risultati sono coerenti con l’idea che M. smegmatis recX svolge un ruolo importante nei processi di riparazione/ricombinazione del DNA in condizioni avverse, forse regolando gli effetti dannosi di un sottoinsieme di geni ancora sconosciuti.

Le abbreviazioni usate sono

DTT, ditiotreitolo; EDTA, acido etilen-diamminotetraacetico; kb, kilobase; MMS, metilmetano solfonato; ODN, oligonucleotide; PAGE, elettroforesi su gel di poliacrilamide; PVDF, membrana in polivinilidene difluoruro; RT-qPCR, reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa; SDS, sodio dodecil solfato; ssDNA, DNA a singolo filamento; SSC, 0.15 M NaCl-0.015 M sodio citrato (pH 7.0) buffer.