L’importanza della fissazione
Per poter studiare i tessuti al microscopio devono essere conservati (fissati) e tagliati in sezioni abbastanza sottili da essere traslucidi. La fissazione è un passo critico nella preparazione delle sezioni istologiche. Se non viene effettuata in condizioni ottimali o se la fissazione viene ritardata, un campione di tessuto può essere danneggiato irreversibilmente. Non importa quanta cura venga posta successivamente nella lavorazione del tessuto, nella microtomia e nella colorazione, le informazioni morfologiche e istochimiche ottenibili dal campione saranno compromesse.
L’obiettivo generale della fissazione dei tessuti è quello di preservare le cellule e i componenti del tessuto in uno “stato simile alla vita” o con la minore alterazione possibile del tessuto vivente, e di fare questo in modo tale da consentire la preparazione di sezioni sottili e colorate. La scelta del fissativo e del protocollo di fissazione può dipendere dalle ulteriori fasi di lavorazione e dalle analisi finali previste. Non esiste un fissativo perfetto, anche se la formaldeide è il più vicino. Pertanto, è disponibile una varietà di fissativi da usare, a seconda del tipo di tessuto presente e delle caratteristiche da dimostrare.
Tipo di fissazione
La fissazione dei tessuti può essere ottenuta con mezzi chimici o fisici.
I metodi fisici includono il riscaldamento, la micro-ondulazione e la crioconservazione (liofilizzazione).
La fissazione chimica si ottiene solitamente immergendo il campione nel fissativo (fissazione per immersione) o, nel caso di piccoli animali o di alcuni organi interi come un polmone, perfondendo il sistema vascolare con il fissativo (fissazione per perfusione). Per alcune procedure istochimiche specializzate i fissativi sono stati occasionalmente applicati in forma di vapore. Per esempio, la paraformaldeide e il tetrossido di osmio possono essere usati per fissare a vapore i tessuti liofilizzati.
- Per saperne di più sulle soluzioni fissative più comuni
Meccanismo di fissazione
I due meccanismi principali della fissazione chimica sono la reticolazione e la coagulazione.
La reticolazione implica la formazione di un legame covalente sia all’interno delle proteine che tra di esse, che causa l’irrigidimento del tessuto e quindi la resistenza alla degradazione.
La coagulazione è causata dalla disidratazione delle proteine attraverso l’uso di alcoli o acetone. Questi reagenti rimuovono e sostituiscono l’acqua libera nelle cellule e nei tessuti e causano un cambiamento nella struttura terziaria delle proteine destabilizzando il legame idrofobico. Viene anche chiamata denaturazione.
Fattori che influenzano la fissazione
- Temperatura: In generale, un aumento della temperatura aumenta il tasso di fissazione, ma anche il tasso di autolisi e di diffusione degli elementi cellulari. Tradizionalmente, da 0 a 4 °C è stata considerata la temperatura ideale per la fissazione dei campioni. Ora la fissazione viene effettuata di routine a temperatura ambiente.
- Dimensione: 1-4 mm di spessore
- Rapporto di volume: Almeno 15-20 volte maggiore del volume del tessuto
- Tempo: 24 – 48 ore
- pH: Dovrebbe essere mantenuto nell’intervallo fisiologico, tra pH 4-9. Il pH per la conservazione dell’ultrastruttura dovrebbe essere tamponato tra 7,2 e 7,4.
Protocolli
- Metodi e protocolli per la decalcificazione del materiale osseo
- Protocollo standard per tessuti fissati in formalina con paraffina
Link utili
- Il processo di fissazione e la Natura dei fissativi
- Soluzioni fissative popolari
- Introduzione di base all’istologia
- Società nazionale di istotecnologia
- Introduzione alla decalcificazione
- Guida pratica alla buona pratica istologica