Braz J Med Biol Res, ottobre 2003, Volume 36(10) 1447-1454
Il gene della 5alfa-reduttasi di tipo 1, ma non di tipo 2, è espresso nei capelli anagen strappati dalla zona del vertice del cuoio capelluto di donne irsute e individui normali
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 e P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Abstract
Abstract 
Lo scopo del presente studio è stato quello di determinare l’espressione dei geni per il tipo 1 (SDR5A1) e tipo 2 (SDR5A2) 5a-reductase isoenzimi nei capelli del cuoio capelluto strappati da 33 pazienti irsute (20 con sindrome dell’ovaio policistico e 13 con irsutismo idiopatico) e confrontarla con quella di 10 uomini e 15 donne normali. L’espressione di SDR5A1 e SDR5A2 è stata stimata mediante RT-PCR usando il gene della proteina ß2-microglobulina espressa ubiquitariamente come controllo interno. I risultati sono espressi come unità arbitrarie in relazione all’assorbanza della ß2-microglobulina (media ± SEM). L’espressione di SDR5A2 non è stata rilevata in nessun campione di capelli analizzato in questo studio. Non sono state trovate differenze nei livelli di mRNA di SDR5A1 tra uomini e donne normali (0,78 ± 0,05 vs 0,74 ± 0,06, rispettivamente). L’espressione del gene SDR5A1 nelle cellule dei capelli strappati dal cuoio capelluto delle donne normali (0,85 ± 0,04) e delle donne con sindrome dell’ovaio policistico (0,78 ± 0,05) e irsutismo idiopatico (0,80 ± 0,06) era anche simile. Questi risultati indicano che l’espressione del gene SDR5A1 nei cheratinociti follicolari della zona del vertice del cuoio capelluto non sembra essere correlata alle differenze nella crescita dei capelli osservate tra uomini e donne normali e pazienti irsute. Sono necessari ulteriori studi per indagare l’espressione dei geni della 5a-reduttasi in altri compartimenti follicolari del cuoio capelluto, come le papille dermiche, e anche nei follicoli piliferi di altri siti del corpo, al fine di chiarire il meccanismo di azione degli androgeni sul processo di crescita dei capelli e sulle malattie correlate.
Parole chiave: Follicolo pilifero, Irsutismo, 5a-Reduttasi, Sindrome dell’ovaio policistico
Introduzione
Gli androgeni sono i principali regolatori della crescita dei capelli umani e sono associati a uno dei principali disturbi clinici della crescita dei capelli, cioè l’irsutismo. Questa condizione corrisponde ad un’eccessiva crescita dei peli del corpo nelle donne con un modello maschile di distribuzione dei peli del corpo. La presenza di irsutismo può segnalare condizioni associate ad un aumento della secrezione di androgeni da parte delle ovaie e/o delle surrenali come la sindrome dell’ovaio policistico (PCOS), tumori secernenti androgeni e iperplasia surrenalica non classica o può derivare da ipersensibilità periferica agli androgeni circolanti (irsutismo idiopatico, IH) (1-3). Anche se in generale questa condizione non è pericolosa per la vita, è molto angosciante per i pazienti e ha un significativo impatto psicosociale negativo. Lo studio degli effetti degli androgeni sulla crescita dei capelli in presenza di irsutismo dovrebbe migliorare la nostra conoscenza della biologia del follicolo pilifero umano.
L’effetto di tutti gli androgeni attivi sulle cellule bersaglio è mediato dal loro legame allo stesso recettore nucleare degli androgeni. Studi precedenti sulle sindromi di resistenza agli androgeni hanno rivelato l’importanza del recettore degli androgeni per la crescita dei capelli androgeno-dipendente (4-6). Più recentemente, è stata osservata una maggiore capacità di legare gli androgeni nelle cellule dei capelli del cuoio capelluto di uomini calvi (7). Tuttavia, nessuna differenza consistente è stata trovata finora nel numero o nella funzione del recettore degli androgeni nei pazienti irsuti rispetto ai soggetti normali (8,9).
I follicoli piliferi hanno un controllo autonomo sul metabolismo degli androgeni, regolando la produzione e la degradazione degli ormoni steroidei secondo le esigenze locali (10). In condizioni normali, la 5a-reduttasi ha un ruolo chiave nell’azione degli androgeni sui follicoli piliferi, convertendo il testosterone nel più potente androgeno diidrotestosterone (11,12). Studi di clonazione molecolare hanno caratterizzato due geni che codificano gli isoenzimi 5a-reduttasi di tipo 1 e di tipo 2 (13,14). L’isoenzima 5a-reduttasi predominante nella pelle è il tipo 1 (SDR5A1) (15), che ha il 60% di omologia con la 5a-reduttasi tipo 2 (SDR5A2) che è caratteristica della ghiandola prostatica (14). Un aumento dell’attività della 5a-reduttasi è stato dimostrato nei fibroblasti della pelle genitale e pubica di pazienti irsute rispetto alla pelle di donne normali (8,16). Questi studi hanno riportato un aumento dell’attività della 5a-reduttasi anche nella IH, che è caratterizzata dall’assenza di elevati livelli plasmatici di androgeni (17). Inoltre, la cute pubica delle pazienti irsute esprime la stessa isoforma SDR5A1 della cute pubica dei soggetti normali, mentre SDR5A2 è espressa principalmente nella cute genitale sia dei soggetti normali che delle pazienti irsute (18). Tuttavia, il ruolo fisiologico degli isoenzimi della 5a-reduttasi non è completamente compreso e la loro distribuzione nei diversi compartimenti della pelle non è ancora chiara. Alcuni studi immunoistochimici e di attività enzimatica hanno suggerito un’espressione predominante dell’enzima SDR5A1 nelle ghiandole sebacee, ma anche nelle ghiandole sudoripare, nelle cellule epidermiche, nella guaina radicolare e nelle cellule della papilla dermica dei follicoli piliferi (19-21), mentre SDR5A2 è espresso in questi compartimenti solo a livelli molto bassi. Al contrario, altri studi hanno dimostrato una diversa distribuzione di questi isoenzimi all’interno dell’unità pilosebacea (22-24). Sembra esserci una maggiore distribuzione di SDR5A1 nei compartimenti del follicolo pilifero rispetto a SDR5A2. Inoltre, poiché i cheratinociti della guaina radicolare mostrano un’alta espressione del gene SDR5A1, probabilmente giocano un ruolo importante nel metabolismo degli androgeni nei follicoli piliferi.
Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare l’espressione dei geni SDR5A1 e SDR5A2 nelle cellule della guaina radicale dei capelli dell’area del vertice del cuoio capelluto di pazienti irsuti e confrontarla con soggetti normali di entrambi i sessi.
Pazienti e metodi
Soggetti
La popolazione dello studio comprendeva donne consultate per irsutismo viste consecutivamente durante un periodo di 6 mesi presso l’Unità di Endocrinologia Ginecologica dell’Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasile. Trentatré pazienti di età compresa tra 12 e 42 anni sono state selezionate per lo studio. A venti pazienti è stata diagnosticata la PCOS e a 13 la IH. La diagnosi di PCOS si basava sulle caratteristiche fisiche di iperandrogenismo, cicli mestruali disturbati, elevati livelli sierici di ormone luteinizzante (LH) o rapporto LH/ormone follicolo-stimolante, aumento dei livelli di testosterone totale e/o indice di androgeni liberi (FAI), evidenza ecografica di ovaie policistiche bilaterali ingrandite (25,26), e assenza di neoplasia ovarica o surrenale o sindrome di Cushing. La IH è stata diagnosticata come precedentemente descritto (27) in pazienti irsute con cicli ovulatori regolari (livelli di progesterone in fase luteale superiori a 3,8 ng/ml), livelli di androgeni normali e senza alcuna malattia di base nota.
I pazienti con iperplasia surrenale congenita ad insorgenza tardiva (non classica) non sono stati considerati per lo studio sulla base di un elevato livello plasmatico di 17-idrossiprogesterone (>5 ng/ml) e/o il suo marcato aumento dopo stimolazione ACTH (>12 ng/ml) (28,29). Sono stati esclusi anche i pazienti con iperprolattinemia (livelli sierici di prolattina superiori a 20 µg/l in due diverse occasioni).
Quindici donne normali con cicli mestruali regolari di età compresa tra 16 e 37 anni e dieci uomini di età compresa tra 16 e 29 anni sono stati selezionati per lo studio, che è stato approvato dal Comitato Etico dell’Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Il consenso informato è stato ottenuto da ogni soggetto. Nessuno dei soggetti aveva ricevuto alcun farmaco noto per interferire con i livelli sierici di androgeni, estrogeni o gonadotropine per almeno 3 mesi prima dello studio.
I livelli di mRNA di SDR5A1 e SDR5A2 sono stati stimati mediante la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR) nelle cellule dei capelli strappati dalla porzione del vertice del cuoio capelluto di uomini normali, donne normali e pazienti irsuti.
Protocollo di studio
Le misure antropometriche comprendevano il peso corporeo, l’altezza e l’indice di massa corporea (BMI = peso attuale misurato in kg diviso per l’altezza in m2). Il punteggio di irsutismo è stato classificato secondo il metodo Ferriman-Gallwey (30), escludendo la parte inferiore delle gambe e dell’avambraccio.
La valutazione ormonale è stata eseguita tra il secondo e il decimo giorno del ciclo mestruale o in qualsiasi giorno in cui le pazienti erano amenorroiche. Dopo un digiuno notturno, sono stati prelevati campioni di sangue da una vena antecubitale per la determinazione di LH, sex hormone-binding globulin (SHBG) e testosterone totale. Tutti i campioni sono stati ottenuti tra le 8 e le 10 del mattino. Il FAI è stato stimato dividendo il testosterone totale (nmol/l) per la SHBG (nmol/l) x 100.
Saggi
Il testosterone totale è stato misurato mediante radioimmunodosaggio a doppio anticorpo (ICN, Costa Mesa, CA, USA), con un limite di rilevamento di 0.04 ng/ml e un coefficiente di varianza (CV) intra- e inter-saggio del 10 e 15%, rispettivamente; la SHBG è stata misurata con un test immunochemiluminometrico (ICMA; DPC, Los Angeles, CA, USA), con un limite di rilevamento di 0,2 nmol/l e un CV intra- e inter-saggio del 5,0 e 8,0%, rispettivamente. L’LH è stato misurato tramite ICMA, con un limite di rilevamento di 0,7 mIU/ml e un CV intra- e inter-saggio di 5,2 e 8,0%, rispettivamente.
Protocollo RT-PCR
I capelli anagen strappati sono stati raccolti dal vertice del cuoio capelluto di tutti i soggetti e sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e trasportati al laboratorio per i test. L’estrazione dell’RNA totale e la sintesi del cDNA sono state effettuate come precedentemente descritto (31). Le radici dei capelli strappati sono state omogeneizzate in fenolo-guanidina isotiocianato (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). L’RNA totale è stato estratto con cloroformio e precipitato con isopropanolo mediante centrifugazione a 12.000 g a 4ºC. Il pellet di RNA è stato lavato due volte con etanolo al 75%, risospeso in acqua trattata con dietilpirocarbonato e quantificato mediante assorbanza a 260 nm.
Il primo filamento di cDNA è stato sintetizzato da 5 µg di RNA totale per tutte le reazioni utilizzando il sistema di preamplificazione SuperScript (Gibco-BRL). Dopo aver denaturato l’RNA modello e i primer a 70ºC per 10 minuti, è stata aggiunta la trascrittasi inversa in presenza di 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, più 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP mix e 10 mM ditiotreitolo, e incubata a 42ºC per 55 minuti. La miscela è stata riscaldata a 70ºC per fermare la reazione e poi incubata con E. coli RNase per 20 minuti a 37ºC per distruggere l’RNA non trascritto. Il template (cDNA) usato nei diversi saggi PCR è stato ottenuto dalla stessa reazione di trascrizione inversa. La PCR è stata effettuata in un volume finale di 50 µl. Due microlitri della reazione di sintesi del primo filamento (con una resa di cDNA prevista di 10 ng) sono stati denaturati a 94ºC per 3 min (2 min solo per la ß2-microglobulina) in presenza di 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, più 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2. Dopo questo avvio a caldo, sono state aggiunte 1,25 U di Taq DNA polimerasi insieme allo stesso buffer Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM di primer senso e antisenso e 0,2 mM di miscela dNTP.
Un frammento di 368-bp della sequenza cDNA di SDR5A1 (24) e un frammento di 566-bp della sequenza cDNA di SDR5A2 (14) sono stati amplificati utilizzando primer progettati per coprire i confini introne-esone al fine di prevenire l’amplificazione di qualsiasi DNA genomico contaminante. Un frammento di cDNA di 623 bp corrispondente alla proteina ß2-microglobulina espressa ubiquitariamente (32) è stato amplificato per normalizzare le quantità di cDNA in ogni campione. Le sequenze di cDNA dei primer di SDR5A1 e SDR5A2 e della ß2-microglobulina sono elencate nella tabella 1. La PCR è stata standardizzata testando un numero di cicli (da 20 a 45) e l’amplificazione è stata eseguita nell’intervallo lineare. Le condizioni finali della PCR erano le seguenti: 35 cicli (45 s a 94ºC, 45 s a 60ºC, 90 s a 72ºC, 10 min a 72ºC) per SDR5A1, 40 cicli (1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 2 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) per SDR5A2, e 30 cicli (1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) per ß2-microglobulina. Il cDNA da cellule dissociate della ghiandola prostatica umana è stato usato come controllo positivo per tutte le reazioni PCR. Nessun cDNA è stato aggiunto alle reazioni negative. Un campione della miscela di PCR (15 µl) è stato frazionato su un gel di agarosio all’1,5-2,0% colorato con bromuro di etidio, eseguito a 100 V e visualizzato sotto la luce UV. Le bande attese sono state quantificate mediante analisi densitometrica utilizzando un sistema di elaborazione delle immagini (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Svezia).
Analisi statistica
I dati sono riportati come media ± SEM, salvo diversa indicazione. Le medie dei gruppi sono state confrontate con il test t di Student o con l’analisi della varianza a una via (ANOVA) seguita dal test di Duncan, e i valori mediani sono stati confrontati con il test di Mann-Whitney. Le differenze sono state considerate statisticamente significative a P < 0,05. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando i pacchetti statistici per le scienze sociali (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
Risultati
La tabella 2 riassume i dati antropometrici e ormonali dei pazienti con PCOS e IH. Non sono state osservate differenze significative tra i due gruppi di pazienti irsute per quanto riguarda l’età o il punteggio clinico per l’irsutismo. Tuttavia, le pazienti irsute con PCOS hanno presentato un BMI più alto e hanno mostrato livelli significativamente più alti di testosterone, FAI e LH rispetto al gruppo IH. Le concentrazioni di SHBG erano più basse nel gruppo PCOS che nel gruppo IH.
L’espressione del gene SDR5A2 non è stata rilevata in nessun campione di capelli del cuoio capelluto analizzato tramite RT-PCR nel presente studio (Figura 1).
La Figura 2 mostra i livelli di mRNA di SDR5A1 nelle cellule dei capelli strappati dal cuoio capelluto di soggetti normali. L’espressione di SDR5A1, presentata come unità arbitrarie in relazione all’assorbanza della ß2-microglobulina, era simile negli uomini (0,78 ± 0,05) e nelle donne normali (0,74 ± 0,06). Inoltre, non sono state osservate differenze significative nell’espressione dei cheratinociti follicolari SDR5A1 tra le donne normali (0.85 ± 0.04) e i gruppi irsuti PCOS (0.78 ± 0.04) o IH (0.80 ± 0.06) (Figura 3).
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Figura 1. Figura 1. Gel di agarosio rappresentativo colorato con bromuro di etidio che non mostra alcuna espressione di mRNA SDR5A2 mediante RT-PCR in cellule pilifere prelevate dal cuoio capelluto di uomini (da 1 a 9), donne normali (da 10 a 17) e pazienti irsute: Gruppo PCOS (da 18 a 31) e gruppo IH (da 32 a 39). Il frammento 566-bp corrisponde a SDR5A2 (5a-R2) e il frammento 623-bp corrisponde a ß2-microglobulina (ß2-m). L’amplificazione di SDR5A2 è stata visualizzata solo in cellule prostatiche dissociate usate come controllo positivo (+). |
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Figura 2. Gel rappresentativo che mostra i livelli di mRNA di SDR5A1 determinati da RT-PCR in cellule capillari strappate dal cuoio capelluto di uomini (da 1 a 7) e donne normali (da 8 a 14). Il frammento 368-bp corrisponde a SDR5A1 (5a-R1) e il frammento 623-bp corrisponde a ß2-microglobulina (ß2-m). I prodotti RT-PCR sono stati visualizzati su gel di agarosio colorato con bromuro di etidio. + = controllo positivo. |
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Figura 3. Gel rappresentativo che mostra i livelli di mRNA di SDR5A1 determinati da RT-PCR in cellule pilifere strappate dal cuoio capelluto di donne normali (da 1 a 14) e di entrambi i gruppi di pazienti irsute (PCOS: da 15 a 26; IH: da 27 a 35). Il frammento 368-bp corrisponde a SDR5A1 (5a-R1), e il frammento 623-bp corrisponde a ß2-microglobulina (ß2-m). I prodotti RT-PCR sono stati visualizzati su gel di agarosio colorato con bromuro di etidio. |
Discussione
Anche se l’attività della 5a-reduttasi cutanea è associata all’irsutismo, il ruolo specifico e l’identificazione dell’isoenzima coinvolto in questa condizione clinica di crescita dei capelli devono ancora essere meglio definiti. Nel presente studio, abbiamo studiato l’espressione dell’mRNA di entrambi i tipi di 5a-reduttasi nelle cellule capillari anagen del cuoio capelluto di pazienti irsute.
Il gene SDR5A1 era espresso nelle cellule capillari spennate ottenute dal vertice del cuoio capelluto di soggetti normali. Altri studi hanno dimostrato risultati simili, anche quando l’mRNA di SDR5A1 è stato studiato in cheratinociti follicolari in coltura (24,33). I peli anagen spennati sono costituiti principalmente da cellule cheratinocitarie che formano sia la guaina esterna che quella interna della radice. La guaina del tessuto connettivo, il bulbo inferiore, le cellule della papilla dermica e la ghiandola sebacea sono assenti nei peli spennati. Pertanto, i nostri dati confermano l’espressione genica di SDR5A1 nei cheratinociti follicolari, e sono in accordo con altri, che hanno mostrato l’immunoreattività della 5a-reduttasi nelle cellule della guaina radicolare dei follicoli piliferi (20,23).
Nel presente studio, i livelli di mRNA di SDR5A1 dai capelli del cuoio capelluto spennati non differiscono tra uomini e donne normali. Studi precedenti hanno anche descritto una simile attività della 5a-reduttasi nei follicoli piliferi di uomini e donne (12,34). Al contrario, negli uomini normali è stata rilevata una maggiore attività della 5a-reduttasi in campioni di pelle pubica rispetto alle donne normali (1). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che negli individui normali la regolazione della 5a-reduttasi sembra differire tra i cheratinociti follicolari del cuoio capelluto e i fibroblasti della pelle pubica.
Le cellule del follicolo pilifero del cuoio capelluto non sembrano essere l’obiettivo principale dell’irsutismo. Tuttavia, ci sono alcune difficoltà etiche nell’ottenere campioni dal viso di pazienti irsute. Inoltre, ci sono solo pochi rapporti in letteratura sui meccanismi molecolari delle cellule del follicolo pilifero del cuoio capelluto in presenza di irsutismo (9). La regione del cuoio capelluto è un noto sito sensibile agli androgeni in entrambi i sessi ed è relativamente facile ottenere un campione di capelli del cuoio capelluto. Pertanto, è interessante indagare alcuni aspetti del metabolismo degli androgeni nelle cellule dei capelli strappati dal cuoio capelluto, in particolare quando è possibile confrontare soggetti con un’esposizione endogena a livelli di androgeni circolanti più elevati (PCOS) o normali (IH).
Non abbiamo osservato alcuna differenza nei livelli di mRNA SDR5A1 nei cheratinociti follicolari né tra pazienti irsute e donne normali né tra uomini e donne normali. Inoltre, le pazienti con alti livelli sierici di androgeni (gruppo PCOS) hanno presentato la stessa espressione genica di SDR5A1 di quelle con IH e livelli normali di androgeni. Mentre SDR5A1 è l’isoenzima predominante nella pelle (14), i presenti risultati indicano che gli androgeni circolanti probabilmente non contribuiscono all’espressione del gene SDR5A1 nei cheratinociti follicolari del cuoio capelluto, suggerendo che SDR5A1 non è l’isoenzima chiave nel metabolismo locale degli androgeni della pelle del cuoio capelluto. D’altra parte, è stata dimostrata l’efficacia dell’inibitore della 5a-reduttasi finasteride nel trattamento della caduta dei capelli maschile (35), così come nella IH (36,37). La finasteride è un inibitore attivo per via orale che blocca preferenzialmente la 5a-reduttasi di tipo 2, ma può anche inibire l’isoenzima di tipo 1, causando una marcata diminuzione dei livelli di diidrotestosterone e di 3a-androstenediolo glucuronide. Non ha né affinità per il recettore degli androgeni né effetti androgeni, estrogenici, progestativi o altri effetti steroidei (38). In accordo con i nostri risultati, questi studi hanno indicato che la 5a-reduttasi di tipo 2 ha probabilmente un ruolo più critico nel processo di crescita dei capelli e nelle condizioni cliniche correlate.
I presenti risultati mostrano che il gene SDR5A2 non era espresso nei cheratinociti follicolari di nessun soggetto, uomini o donne normali o pazienti irsute. Studi precedenti hanno descritto la localizzazione preferenziale dell’mRNA e dell’attività enzimatica di SDR5A2 (39,40) nelle cellule della papilla dermica, sebbene l’immunoreattività di SDR5A2 sia stata trovata anche nei cheratinociti del follicolo pilifero (20,22). Le apparenti discrepanze nell’espressione della proteina tra questi studi possono essere spiegate, almeno in parte, dai diversi metodi di analisi immunoistochimica dei dati qualitativi. Per quanto riguarda l’assenza di espressione del gene SDR5A2, descritta nel presente studio, metodi più sensibili di analisi dell’espressione genica, ad esempio, la PCR in tempo reale, potranno forse chiarire questa questione in futuro.
Non abbiamo studiato l’espressione genica degli isoenzimi della 5a-reduttasi in altri compartimenti follicolari come le papille dermiche perché queste cellule non sono presenti nei capelli isolati spennati. Le cellule della papilla dermica sono ottenute solo tramite biopsia di escissione, che è un metodo invasivo e stressante. Tuttavia, sarà molto interessante studiare gli isoenzimi della 5a-reduttasi nelle cellule della papilla dermica dei pazienti irsuti, poiché è stato suggerito che queste cellule possono essere il bersaglio diretto degli androgeni nei follicoli piliferi, regolando l’attività della matrice dei capelli, dei melanociti e dei cheratinociti con segnali paracrini (10).
L’espressione del gene SDR5A1 nei cheratinociti follicolari della zona del vertice del cuoio capelluto non sembra essere collegata alle differenze nella crescita dei capelli osservate tra uomini e donne normali e pazienti irsuti. Ulteriori indagini sulla regolazione dell’espressione genica della 5a-reduttasi nelle cellule del follicolo pilifero in diversi siti del corpo possono aiutare a chiarire l’intrigante meccanismo di azione degli androgeni sul processo di crescita dei capelli e sulle malattie associate.
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