Abstract
Background. L’infezione persistente da papillomavirus umano (HPV) è un evento necessario nella tumorigenesi del cancro cervicale. I nostri obiettivi erano di stimare il tasso di persistenza dell’infezione da HPV dopo l’escissione della zona di trasformazione (LEEP) in pazienti con lesioni squamose intraepiteliali di alto grado (HSIL) e di studiare se la persistenza di HPV è legata al tipo. Metodi. Abbiamo condotto uno studio prospettico su 89 pazienti con HSIL trattate con LEEP. Il DNA HPV è stato eseguito prima dell’intervento e a 6, 12 e 18 mesi dopo la LEEP. Risultati. Quattro pazienti sono stati esclusi dallo studio. La persistenza dell’HPV nei restanti 85 pazienti era del 32,95% (6 mesi), del 14,12% (12 mesi) e del 10,59% (18 mesi). Il tipo 16 ha avuto il più alto tasso di persistenza, 23,5% (6 mesi), 11,8% (12 mesi), e 8,2% (18 mesi). La coinfezione è stata trovata al 54,12% prima della LEEP e al 18,8% (6 mesi), 4,7% (12 mesi), e 3,5% (18 mesi) dopo la LEEP. Il tasso di coinfezioni compreso il tipo 16 era il 46.83% di tutte le coinfezioni. La coinfezione comprendente il tipo 16 non era correlata a un tasso di persistenza più elevato rispetto all’infezione con il solo tipo 16. Conclusioni. L’infezione da HPV non è completamente eradicata dalla LEEP in pazienti con lesioni HSIL sullo striscio PAP. La persistenza dell’HPV dopo la LEEP è influenzata dal tipo di HPV. Il tipo di HPV 16 ha il più alto tasso di persistenza.
1. Introduzione
L’infezione persistente da papillomavirus umano (HPV) è un evento necessario nella tumorigenesi del cancro cervicale. Praticamente tutte le cellule tumorali in un cancro cervicale contengono sequenze di HPV. L’HPV è la malattia a trasmissione sessuale più frequente nel mondo. La maggior parte delle infezioni sono transitorie, fino al 70% regredisce nel primo anno e fino al 90% in 2 anni; il 10-20% delle infezioni persiste, permettendo l’evoluzione delle lesioni preneoplastiche al cancro. Solo 40 dei 200 genotipi HPV conosciuti presentano un tropismo per la mucosa anogenitale e 18 di questi 40 tipi sono direttamente correlati al cancro cervicale. Quindici tipi di HPV sono stati definiti come tipi di papilloma virus umano ad alto rischio (HR-HPV) con un forte potenziale oncogeno: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82. Questi tipi di HR-HPV rappresentano il 95% di tutti i cancri cervicali. Le infezioni simultanee con più tipi di HPV sono comuni.
HPV 16 e 18 sono i tipi HR-HPV più comuni in tutto il mondo e rappresentano circa il 70% di tutti i carcinomi a cellule squamose (SCC) e fino all’85% di tutti gli adenocarcinomi. HPV 16 è il genotipo HPV più cancerogeno e HPV 18 causa una proporzione maggiore di tumori ghiandolari rispetto al carcinoma a cellule squamose. Dopo HPV 16 e 18, i sei tipi più prevalenti che rappresentano un ulteriore 20% sono i tipi 31, 33, 35, 45, 52, e 58 .
L’escissione della cervice uterina come la large loop excision della zona di trasformazione (LEEP) non è solo una procedura diagnostica ma anche un trattamento adeguato per la neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN) . Tuttavia, la CIN può recidivare, e il carcinoma cervicale invasivo può svilupparsi, dopo tale trattamento CIN. C’è una crescente evidenza che il test per la presenza del papilloma virus umano ad alto rischio (HR-HPV) dopo la LEEP può aiutare a prevedere la probabilità di malattia persistente o ricorrente.
Gli obiettivi del nostro studio erano di stimare il tasso di persistenza dell’infezione da HPV dopo la LEEP in pazienti con lesioni squamose intraepiteliali di alto grado (HSIL) e di indagare se la persistenza di HPV è legata al tipo.
2. Materiali e metodi
Selezione dei pazienti. Abbiamo eseguito uno studio prospettico. Abbiamo incluso nello studio tutte le pazienti con citologia HSIL su PAP smear che sono state indirizzate per LEEP al Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia dell’Università di Medicina e Farmacia “Victor Babeş”, Timişoara, tra gennaio 2010 e maggio 2014. La citologia convenzionale è stata eseguita e valutata secondo i criteri di Bethesda 2001. Tutte le pazienti sono state valutate mediante colposcopia e sono stati utilizzati i criteri della Federazione internazionale per la patologia cervicale e la colposcopia (IFCPC). Tutte le pazienti sono state sottoposte a LEEP sotto visione colposcopica dopo l’applicazione della soluzione di Lugol. Durante la procedura, tutti i reperti colposcopicamente anormali sono stati escissi, mirando ad una profondità di tessuto di almeno 6 mm. Tutte le procedure sono state eseguite dallo stesso team di chirurghi. Il test HPV del DNA è stato eseguito prima della LEEP in tutti i casi. Il test del DNA HPV è stato ripetuto a 6, 12 e 18 mesi dopo la LEEP. I pazienti che erano negativi per il DNA HPV prima della LEEP sono stati esclusi dallo studio. Tutti i campioni sono stati esaminati utilizzando il test di genotipizzazione LINEAR ARRAY HPV (CE-IVD), basato sull’ibridazione inversa degli ampliconi. Il DNA di 37 tipi di HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 e CP6108) è stato rilevato nei campioni cervicali mediante PCR multiplex mirata alla regione L1 conservata del genoma virale. Il Gene Amp PCR System 9700 è stato utilizzato per il test di genotipizzazione secondo le istruzioni del produttore. L’ibridazione automatica e la rilevazione del DNA dell’HPV sono state effettuate su ProfiBlot 48 (Tecan Trading AG, Zurigo, Svizzera).
Tutti i campioni sono stati inviati all’esame istopatologico. I pazienti con margini di resezione positivi dopo la LEEP sono stati esclusi dallo studio.
Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima della loro inclusione nello studio. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le norme etiche stabilite nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche e sono state approvate dall’Institutional Review Board e dal Comitato Etico dell’Università di Medicina e Farmacia “Victor Babeş”, Timişoara.
L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS v17 e Epi Info 7. Per il calcolo dei valori abbiamo usato test non parametrici (Wilcoxon sign rank e chi quadrato).
3. Risultati
Un totale di 89 pazienti sono stati inviati alla nostra clinica con HSIL su PAP smear test. Dopo il primo test HPV del DNA, 2 pazienti sono state trovate negative e sono state escluse dallo studio. Abbiamo escluso queste pazienti perché volevamo studiare la persistenza dell’HPV dopo la LEEP. Poiché non c’era infezione prima della LEEP, abbiamo escluso i pazienti dallo studio.
Altri 2 pazienti avevano margini positivi sul campione LEEP e sono stati anche esclusi dallo studio. Le restanti 85 pazienti sono state testate per il DNA HPV a 6, 12 e 18 mesi dopo la LEEP. Tutte le altre pazienti erano positive per l’HR-HPV prima della LEEP. I tipi di HPV rilevati prima della LEEP erano: 50,6% tipo 16, 24,7% tipo 18, 20% tipo 31, 24,7% tipo 33, 11,8% tipo 35, 7,1% tipo 45, 27,1% tipo 52, 9,4% tipo 58, 9,4% tipo 6, 5,9% tipo 11 e 5,9% altri tipi. A 6 mesi dopo la LEEP, la persistenza complessiva era del 32,95% (28 pazienti), a 12 mesi del 14,12% (12 pazienti), e a 18 mesi del 10,59% (9 pazienti). Il tasso di persistenza nel nostro gruppo a 6, 12 e 18 mesi per ogni tipo di HPV è mostrato nella tabella 1. La persistenza virale a 12 e 18 mesi è stata osservata solo nelle pazienti positive a 6 mesi. Il tipo 16 è stato trovato con il più alto tasso di persistenza, 23,5% a 6 mesi, 10,6% a 12 mesi, e 8,2% a 18 mesi. Il tipo 16 era associato a un rischio significativamente maggiore di persistenza rispetto agli altri tipi ad alto rischio (tabella 2).
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| Differenze significative (con 0.05; 0,01; e 0,001 livello di significatività). Differenze non significative (con 0,05 livello di significatività). Dalla seconda tabella possiamo vedere che il tipo di HPV più frequente è il 16. Inoltre, questo tipo di HPV sembra essere il più persistente e pericoloso. Possiamo vedere che ci sono differenze estremamente significative tra HPV 16 e gli altri tipi di HPV, nella maggior parte dei casi. |
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La coinfezione, definita come la presenza di più di un tipo di HPV, è stata trovata al 54,12% prima della LEEP, al 18,8% a 6 mesi, al 4,7% a 12 mesi e al 3,5% a 18 mesi dopo la LEEP (Tabella 1). Le coinfezioni che includevano il tipo 16 rappresentavano il 46.83% di tutte le coinfezioni. I pazienti positivi per il tipo 16 sono risultati avere un rischio significativamente più alto di persistenza dell’infezione rispetto ai pazienti che presentavano infezioni o coinfezioni con altri tipi (Tabelle 3 e 4). La coinfezione che includeva il tipo 16 non era correlata a un tasso di persistenza più elevato rispetto all’infezione con il solo tipo 16 (tabella 5).
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4. Discussione
Il cancro cervicale rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità nelle donne di tutto il mondo. È causato dall’acquisizione e dalla persistenza di tipi di infezione da papilloma virus umano ad alto rischio (HR-HPV) e dalla successiva trasformazione maligna delle cellule epiteliali cervicali. L’infezione persistente da HPV è un fattore importante nello sviluppo di CIN. La storia naturale della progressione dell’infezione da HPV verso la lesione cervicale o la clearance è stata studiata da Jaisamrarn et al. 2013. Hanno scoperto che complessivamente il 53%, 79%, 87% e 89% di tutte le infezioni da HPV sono state eliminate a 12, 24, 36 e 48 mesi, rispettivamente, e che l’HPV 16 e l’HPV 31 avevano significativamente meno probabilità di essere eliminati rispetto a un HPV nononcogeno. La persistenza dell’infezione da HPV ad alto rischio è un fattore chiave per lo sviluppo del cancro cervicale, e la rilevazione della persistenza virale può essere utilizzata per identificare le donne con il maggior rischio di cancro cervicale.
L’escissione della cervice è considerata una procedura sia diagnostica che terapeutica che può efficacemente sradicare l’infezione da HR-HPV e CIN. Nonostante la rimozione dell’intera lesione mediante escissione conica con margini negativi, l’infezione da HPV può persistere in alcuni casi. Gli studi che indagano la clearance/persistenza dell’infezione da HPV dopo la LEEP hanno riportato che l’età, il grado della lesione e lo stato dei margini sono fattori di rischio per la persistenza dell’HPV. Il nostro tasso di persistenza a 6 mesi era del 32,95%. Altri autori, utilizzando la stessa procedura, hanno riportato tassi inferiori di persistenza dell’HPV a 6 mesi, che vanno dal 14,3% al 21,5%. Riteniamo che la selezione di soli pazienti con HSIL e il fatto che tutti i pazienti nel nostro studio avevano infezioni da HR-HPV siano responsabili del nostro più alto tasso di persistenza. Park et al. e Nam et al. hanno anche trovato che le lesioni di alto grado sono fattori di rischio per la persistenza di HPV dopo LEEP.
Abbiamo escluso le pazienti con margini positivi dopo la resezione dal nostro studio perché volevamo indagare la persistenza dell’infezione da HPV nelle pazienti con margini negativi. La presenza di margini positivi è considerata un fattore importante per la persistenza dell’HPV e la recidiva e la progressione della malattia. Alonso et al. 2006 hanno trovato che i margini positivi del cono erano significativamente associati ad un più alto rischio di recidiva. Abbiamo selezionato pazienti con HSIL perché è più probabile che abbiano un’infezione da HPV con tipi ad alto rischio, e le lesioni HSIL hanno maggiori probabilità di progredire verso la malattia invasiva. Abbiamo escluso i pazienti con HPV DNA negativo prima della LEEP perché il nostro obiettivo era quello di studiare la persistenza dell’infezione da HPV dopo la LEEP.
Diversi autori hanno studiato e trovato che la carica virale prima della LEEP è un fattore di rischio per la persistenza di HPV. Cariche virali elevate, RLU/PC ≥ 100, sono state considerate fattori di rischio per la persistenza dell’HPV e la ricorrenza della malattia. Poiché la misurazione della carica virale dell’HPV non è ampiamente disponibile, abbiamo studiato se il rischio di persistenza dell’HPV dopo la LEEP è legato a certi tipi di HPV. Riteniamo che questo sia utile per la stratificazione del rischio e la selezione del gruppo di pazienti da valutare più attentamente. Ci siamo concentrati sulla persistenza legata al tipo, perché il DNA HPV è un test più utilizzato rispetto alla valutazione della carica virale dell’HPV.
L’identificazione dello stesso tipo di HPV prima e dopo la LEEP è stata considerata persistenza. Non abbiamo trovato nuovi tipi di HPV dopo la LEEP in nessun paziente. La persistenza virale a 12 e 18 mesi è stata trovata solo nei pazienti positivi a 6 mesi dopo la LEEP. Riteniamo che la probabilità di reinfezione durante lo studio sia bassa, anche se è difficile escluderla completamente.
Nel nostro studio il tipo 16 di HPV è stato trovato come un fattore che favorisce la persistenza di HPV dopo la LEEP. I nostri risultati sono in accordo con Nam et al. 2009 che hanno studiato i fattori associati alla persistenza dell’HPV dopo la conizzazione in un gruppo simile (77 pazienti) e hanno trovato che l’infezione preoperatoria da HPV di tipo 16 era l’unico fattore indipendente significativo () per la persistenza dell’HPV rispetto all’età, alla citologia, all’istologia della biopsia del punch, alla carica virale dell’HPV e all’istologia della conizzazione.
I nostri risultati indicano anche che la maggior parte delle infezioni da HPV sono eliminate a 12 mesi dall’intervento, e molto poche sono eliminate dopo questo intervallo. Suggeriamo che l’endpoint di follow-up dell’HPV DNA dopo la LEEP sia di 12 mesi. Riteniamo inoltre che i pazienti con persistenza dell’infezione dopo 12 mesi abbiano maggiori probabilità di sviluppare una progressione della malattia piuttosto che la clearance dell’infezione, ma sono necessari più dati per dimostrare questa affermazione. Suggeriamo che l’HPV DNA a 12 mesi dopo la LEEP potrebbe essere uno strumento utile, al fine di identificare le pazienti che hanno probabilità di sperimentare la progressione della malattia.
La persistenza o la clearance dell’HPV DNA è considerata un marker prognostico precocemente valido di fallimento o cura dopo il trattamento della displasia cervicale ed è più accurato della citologia o dello stato dei margini di sezione al momento della LEEP. Secondo la meta-analisi eseguita da Kocken et al. 2012 il test HPV dovrebbe essere incluso nei test post-trattamento 6 mesi dopo il trattamento, perché ha una sensibilità superiore alla citologia nel rilevare la malattia post-trattamento di alto grado e ha una specificità simile. La ricorrenza della displasia cervicale dopo la LEEP è anche legata alla persistenza dell’HPV. Diversi ricercatori hanno analizzato la sensibilità e la specificità del test HPV DNA rispetto alla citologia di follow-up per rilevare più accuratamente la malattia residua/recidiva dopo il trattamento. Il test HPV è risultato essere più sensibile della citologia di follow-up, con una specificità comparabile. Le donne che sono HPV positive dopo l’intervento chirurgico sono a maggior rischio di fallimento del trattamento.
Abbiamo notato la persistenza dei tipi 6 e 11 a 12 mesi. Questo è stato riportato anche da Brismar et al. Questi non sono considerati tipi ad alto rischio, ma sono associati al condiloma.
L’interesse per la coinfezione con più tipi di HPV è aumentato negli ultimi anni, insieme alla possibilità di vaccinazione e anche a causa della scoperta che la risposta immunitaria sembra essere specifica del tipo.
L’incidenza della coinfezione riportata in letteratura è variabile, dal 19% fino al 43,2%. Ciò è dovuto a fattori come l’età, il comportamento sessuale, la risposta immunitaria e il metodo di rilevamento dell’HPV. Il nostro tasso di coinfezione era del 54,12%, e il tasso di coinfezioni comprendenti il tipo 16 era del 46,83% di tutte le coinfezioni.
In uno studio su 1124 pazienti, Liaw et al. hanno trovato che l’HPV 16 era persistito più a lungo di altri tipi, ma non alterava la successiva persistenza di altre infezioni concomitanti da HPV. Questo concorda con i nostri risultati che il tipo 16 ha il più alto tasso di persistenza (Tabella 2). Abbiamo anche trovato che l’infezione con il tipo 16 ha un tasso di persistenza più alto rispetto alla coinfezione senza tipo 16 (Tabella 3). La coinfezione che include il tipo 16 non era correlata con un tasso di persistenza più alto rispetto all’infezione con il solo tipo 16 (tabella 5). Questo indica che la presenza del tipo 16 è il fattore più importante per la persistenza dell’infezione.
I punti di forza dello studio sono rappresentati dalla natura prospettica dello studio e dal fatto che solo i pazienti con HSIL sono stati selezionati. In questo modo abbiamo indagato proprio la categoria di pazienti che hanno la probabilità di essere infettate da HR-HPV e che sono esposte alla recidiva dopo LEEP e alla progressione della malattia verso il cancro.
5. Conclusioni
L’infezione da HPV non è completamente eradicata dalla LEEP in pazienti con lesioni HSIL sullo striscio PAP. La persistenza dell’HPV dopo la LEEP è influenzata dal tipo di HPV. Il tipo 16 di HPV ha il più alto tasso di persistenza.
I nostri risultati raccomandano fortemente l’introduzione del test HPV DNA nel follow-up dei pazienti che si sono sottoposti a LEEP per HSIL, soprattutto se il tipo 16 di HPV è stato identificato prima della LEEP.
Punti aggiuntivi
Il nome del registro è Laurențiu Pirtea.
Interessi concorrenti
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Riconoscimenti
Questo articolo è stato sostenuto da Grant PII-C2-TC-2014-06, Università di Medicina e Farmacia “Victor Babeş”, Timişoara, Romania.
Materiale supplementare
I dati utilizzati per l’analisi statistica per quanto riguarda l’infezione da HPV con l’HPV-DNA testato, determinato prima della LEEP (1 = presente, 0 = assente), e a 6, 12, e 18 mesi dopo la LEEP, e anche l’età dei pazienti studiati.
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