La scoperta a sorpresa di un nuovo percorso governato dalla proteina di segnalazione Notch apre le porte per un migliore sviluppo dei farmaci
di Lindsay Brownell
(BOSTON) – Ogni minuto, un gallone e mezzo di sangue pulsa attraverso la rete di vene e arterie del corpo. La forza di quel flusso sanguigno aiuta a mantenere sane le cellule che rivestono i vasi sanguigni, chiamate cellule endoteliali; quando il flusso sanguigno è interrotto, come durante le procedure chirurgiche o un ictus, i vasi iniziano a perdere, il che può causare una serie di risposte infiammatorie che portano a danni cellulari e malattie. Gli scienziati del Wyss Institute dell’Università di Harvard hanno cercato di risolvere il mistero di come il flusso sanguigno mantenga i vasi intatti e, con loro grande sorpresa, hanno scoperto una via di segnalazione cellulare completamente nuova che è un obiettivo promettente per i farmaci per trattare una varietà di condizioni debilitanti.
“Abbiamo scoperto che la nota proteina Notch è responsabile di evitare che i vasi sanguigni perdano, e lo fa attraverso una via di segnalazione secondaria che opera in modo completamente diverso dalla sua nota via basata sulla trascrizione”, dice Chris Chen, M.D., Ph.D., membro associato della facoltà del Wyss Institute e direttore fondatore del Biological Design Center e professore emerito di ingegneria biomedica alla Boston University, che è l’autore corrispondente del documento. “Non solo questo nuovo percorso è eccitante dal punto di vista della scoperta, ma potrebbe migliorare alcuni degli effetti collaterali dei farmaci antitumorali e cardiovascolari per renderli più sicuri ed efficaci”. Lo studio è pubblicato oggi su Nature.
Le cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni sono collegate strettamente insieme attraverso connessioni chiamate giunzioni di aderenza per formare una barriera che mantiene il sangue all’interno del vaso e regola quanto facilmente altre sostanze possono passare dentro e fuori di esso. Per studiare questa barriera e determinare perché la mancanza di flusso sanguigno provoca una perdita, i ricercatori hanno costruito un modello di blood-vessel-on-a-chip che consiste in un canale rivestito con uno strato di cellule endoteliali umane circondate da matrice extracellulare all’interno di un dispositivo microfluidico, che ha permesso loro di simulare facilmente e controllare il flusso di sangue attraverso un vaso e valutare le risposte delle cellule.
Le cellule endoteliali che hanno sperimentato il flusso di sangue hanno mostrato una maggiore attività della proteina transmembrana Notch1, mentre le cellule esposte a sangue statico non lo hanno fatto. Quando i ricercatori hanno aggiunto una sostanza chimica che blocca l’attivazione di Notch1 impedendo al suo dominio intracellulare di staccarsi, hanno osservato che il vaso ha iniziato a perdere, cosa che hanno determinato essere causata dalla rottura delle giunzioni di aderenza tra le cellule endoteliali vicine e la riorganizzazione delle fibre di actina all’interno di ogni cella. Questo ha confermato che l’attivazione di Notch1 da parte del flusso sanguigno è necessaria per la formazione e il mantenimento della barriera endoteliale dei vasi sanguigni.
Curiosamente, impedendo al dominio intracellulare di Notch1 di iniziare la trascrizione dopo il distacco (che è il meccanismo d’azione consolidato di Notch1) non ha fatto sì che i vasi perdessero, il che implica che qualche altra parte della proteina la cui funzione non coinvolge la trascrizione rispondeva al flusso sanguigno. Questo sospetto è stato rafforzato da esperimenti in vivo in cui gli scienziati hanno iniettato ai topi una sostanza chimica che ha bloccato Notch1 insieme a un colorante blu, e hanno visto che il colorante perdeva dai vasi sanguigni dei topi trattati a un ritmo molto più veloce del previsto. “La trascrizione di un gene in una proteina che poi svolge qualche funzione all’interno della cellula richiede generalmente circa due ore, ma noi vedevamo perdite entro 30 minuti, suggerendo ulteriormente che qualsiasi processo controlli la permeabilità della barriera sta operando attraverso un meccanismo completamente diverso”, dice Bill Polacheck, Ph.D, Postdoctoral Fellow presso il Wyss Institute e co-first author dell’articolo.
Una volta stabilito che il dominio intracellulare non era coinvolto nella regolazione della barriera endoteliale, gli scienziati hanno esaminato altre parti di Notch1 per attività. Hanno usato CRISPR/Cas-9 per eliminare varie sezioni del gene Notch1, e hanno scoperto che l’eliminazione della sezione che codifica per il dominio intracellulare non ha avuto alcun effetto sulla permeabilità, mentre l’eliminazione della piccola sezione del dominio transmembrana (TMD) ha causato un aumento delle perdite dei vasi in condizioni di flusso. “Questa è la prima volta che la funzione biologica del TMD di Notch è stata valutata”, dice Matthew Kutys, Ph.D., Visiting Fellow al Wyss Institute e co-first author. “Si presumeva in gran parte che fosse inerte e che sparisse dopo l’attivazione, e la maggior parte dei libri di testo e dei documenti di ricerca non lo mostrano nemmeno come una porzione distinta dei recettori Notch”. Attraverso ulteriori test, hanno scoperto che quando Notch1 viene attivato e il suo dominio intracellulare viene rilasciato, il suo TMD assembla un complesso nella membrana con le proteine VE-caderina, Rac1, LAR, e Trio, che collettivamente assemblano e mantengono le giunzioni aderenti tra le cellule e distribuiscono le fibre di actina contro la membrana cellulare per sostenere tali giunzioni.
“In retrospettiva, abbiamo tirato i dadi con questo progetto, perché scegliendo di studiare Notch siamo entrati in una delle aree di ricerca più affollate della biologia. Ma il nostro approccio basato sull’ingegneria ci ha permesso di studiarlo in un modo nuovo, senza l’influenza o il pregiudizio del lavoro passato, che penso sia ciò che ci ha reso abbastanza aperti da osservare e caratterizzare questo nuovo, inaspettato percorso”, dice Polacheck. “Sapere che Notch1 regola l’adesione cellulare oltre alla differenziazione cellulare offre anche un nuovo quadro per la comprensione del coordinamento dei complessi processi cellulari, in quanto singole molecole come Notch possono svolgere ruoli multipli”, aggiunge Kutys.
La rivelazione che Notch1 serve diverse funzioni, e sapere quali parti della proteina governano ogni funzione, permette lo sviluppo di nuovi farmaci che sono sia più efficaci che meno tossici. “Notch è un bersaglio per alcune terapie del cancro, ma questi farmaci sono noti per causare edema e altri problemi. Ora, stiamo lavorando attivamente sulla separazione delle due vie di Notch in modo da poter creare farmaci che mirano solo al dominio intracellulare, risparmiando il TMD e quindi preservando l’integrità dei vasi sanguigni”, dice Karen Hirschi, Ph.D., professore di medicina e genetica alla Yale School of Medicine, che ha collaborato allo studio. Sapere che Notch governa la permeabilità dei vasi lo rende un candidato per nuovi farmaci per il trattamento delle malattie cardiovascolari, e il team sta anche studiando il TMD come un potenziale agente terapeutico stesso, come modelli cellulari che sono stati esposti a infiammazioni che inducono perdite hanno mostrato una drastica riduzione delle perdite quando sono stati ingegnerizzati per esprimere il TMD.
“Le collaborazioni che il Wyss Institute consente e alimenta tra campi disparati, come l’ingegneria meccanica e la biologia molecolare, favoriscono nuovi approcci a vecchi problemi che possono portare a risultati veramente paradigmatici”, dice Donald Ingber, M.D. Ph.D, il direttore fondatore del Wyss Institute e il Judah Folkman Professor di biologia vascolare alla Harvard Medical School e il programma di biologia vascolare all’ospedale pediatrico di Boston, che è anche professore di bioingegneria alla Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). “Questo studio è un ottimo esempio dei benefici che questi tipi di partnership possono fornire alla scienza e alla società.”
Autori aggiuntivi dello studio sono Jinling Yang, Ph.D., Postdoctoral Fellow al Wyss Institute; Jeroen Eyckmans, Ph.D, ex borsista post-dottorato Wyss e attuale capogruppo alla Boston University; Yinyu Wu, studente laureato nel dipartimento di genetica a Yale; e Hema Vasavada, responsabile di laboratorio alla Yale School of Medicine.
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH), la National Science Foundation (NSF), un Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation, e il Wyss Institute dell’Università di Harvard.
- PUBBLICAZIONE – Nature: Un complesso Notch non canonico regola le giunzioni di aderenza e la funzione di barriera vascolare
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