Acidi Nucleici
Come molte molecole biologiche gli acidi nucleici sono polimeri, lunghe molecole formate da unità ripetute. Negli acidi nucleici, l’unità ripetuta è il nucleotide. Un nucleotide consiste in uno zucchero a cinque carbonio, una base contenente azoto e un gruppo fosfato. I due tipi primari di acidi nucleici, l’acido desossiribonucleico (DNA) e l’acido ribonucleico (RNA), possiedono zuccheri leggermente diversi nei loro rispettivi nucleotidi e un diverso insieme di quattro basi che possono essere contenute dai loro nucleotidi.
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| DNA Nucleotide | |
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| Nucleotide di RNA | La struttura di una sezione di una molecola di RNA. |
Nota la presenza di un gruppo idrossile sul 2′ carbonio dello zucchero moety.
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| Adenina – DNA e RNA |
Guanina – DNA e RNA |
Timina –
DNA e RNA |
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| Citosina – DNA e RNA |
Uracil – Solo RNA |
Di grande importanza per l’elettroforesi è la ionizzazione dei gruppi fosfato, dando agli acidi nucleici una grande carica negativa netta. Poiché ogni nucleotide è ionizzato, il rapporto carica/massa di due diverse molecole di acido nucleico sarà molto simile.
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| I gruppi fosfato di ogni nucleotide portano una carica formale negativa. Poiché ogni nucleotide porta la stessa carica, il rapporto carica/massa di diverse molecole di acido nucleico è quasi identico. La forza elettrica fa sì che le molecole di acido nucleico caricate negativamente migrino verso il polo positivo. | |
DNA e RNA contengono ciascuno quattro possibili nucleotidi corrispondenti all’insieme di quattro possibili basi (adenina, guanina, timina e citosina per il DNA; adenina, guanina, uracile e citosina per l’RNA). Ogni base mostra una particolare affinità per una delle altre tre basi, sulla base di simmetrie di legame idrogeno. La base azotata adenina si “accoppia” con la timina (o l’uracile nell’RNA). La guanina si “accoppia” con la citosina. A causa dell’accoppiamento delle basi, il DNA o l’RNA possono esistere come varianti a filamento singolo o doppio. La forma a doppio filamento consiste in due filamenti complementari uniti dall’accoppiamento di basi.
L’accoppiamento di basi di due filamenti complementari permette alle molecole di acido nucleico di assumere una forma a doppio filamento.
L’accoppiamento di basi può avvenire anche nel DNA o RNA a filamento singolo. Una sezione contenente una sequenza di nucleotidi spesso tornerà indietro e si accoppierà con una sezione complementare sulla stessa catena. Questo influenzerà la struttura tridimensionale della molecola, con implicazioni per le separazioni elettroforetiche. In generale, i lunghi filamenti di DNA o RNA si trovano in una conformazione di base accoppiata, sia a doppio filamento che a filamento singolo con accoppiamento interno. Gli acidi nucleici non appaiati, o “denaturati”, si trovano in soluzione solo in condizioni speciali che destabilizzano le coppie di basi.
L’appaiamento di basi non è limitato alle varianti a doppio filamento, ma può avvenire anche all’interno della stessa molecola. Le conformazioni risultanti possono portare a risultati di elettroforesi che sono difficili da interpretare.
L’elettroforesi di DNA o RNA a doppio filamento è chiamata elettroforesi su gel nativo. L’elettroforesi di DNA o RNA a singolo filamento avviene in condizioni di denaturazione. La formamide e l’urea sono i due agenti più comuni che realizzano la denaturazione chimica. Queste sostanze agiscono per interrompere il legame idrogeno tra le basi azotate, rimuovendo così gli effetti dell’accoppiamento delle basi. Di solito viene impiegata una combinazione di formamide, urea e calore durante il processo di elettroforesi denaturante, dalla preparazione del campione all’esecuzione del gel. Gli scopi delle condizioni di denaturazione sono di assicurare molecole a singolo filamento e di prevenire cambiamenti conformazionali dovuti all’accoppiamento di basi tra diverse sezioni della stessa molecola di DNA o RNA. Le condizioni di elettroforesi denaturante permettono un rapporto coerente tra la dimensione molecolare e la mobilità attraverso il gel.
Formamide e urea realizzano la denaturazione del DNA o RNA formando nuovi legami idrogeno con le basi delle molecole di acido nucleico, interrompendo i legami idrogeno che portano all’accoppiamento delle basi.
TECNOLOGIA AVANTI: Macromolecole biologiche-Acidi nucleici
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