Risultati e discussione
Il saggio di ‘flusso autofagico’ descritto in Jiang et al. è un saggio quantitativo della proteina fluorescente verde (GFP) che misura i cambiamenti ratiometrici di polyQ-GFP a GFP libera tramite analisi Western blot. Un costrutto reporter multicistronico è stato progettato per codificare due proteine; polyQ legato a N-terminale GFP e GFP libero. La sequenza virale 2A (v2A) è stata posta come una regione di collegamento tra le sequenze che codificano per le due proteine per consentire la traduzione stechiometrica di due proteine separate da un telaio di lettura aperto (Fig. 1a).
Generazione dei costrutti putativi Q52, Q31 e Q10-GFP utilizzando il costrutto multicistronico reporter Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. a Mappa vettoriale del costrutto Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. b Riassunto dell’uso dei codoni degenerati CAA e CAG in questo costrutto. c Cromatografia del costrutto raffigurante la glutammina casualmente interspaziati codifica CAG e CAA triplette. d Illustrazione schematica di PCR-based esclusione amplificazione del Q80-GFP contenente costrutto per generare costrutti polyQ con un numero inferiore di ripetizioni glutammina. e Q80 sequenza che mostra Q52, Q31 e Q10 siti di legame primer. f Sequenze di primer destinati a generare Q52, Q31 e Q10 costrutti. g Analitica gel elettroforesi agarosio per ciascuno dei vettori putativo Q80, Q52, Q31 e Q10 utilizzando primer fiancheggiando la regione polyQ. Le dimensioni dei prodotti PCR di ~ 270, ~ 180, ~ 120 e ~ 60 bp per i costrutti putativi Q80, Q52, Q31 e Q10-GFP, rispettivamente, sono state viste
Abbiamo progettato una sequenza polyQ contenente 80 ripetizioni di glutamina (Q80). La sequenza è stata progettata per avere una bassa somiglianza di ripetizioni intervallando in modo casuale triplette CAG codificanti glutammina con triplette CAA codificanti glutammina (Fig. 1b, c). Le sostituzioni nucleotidiche sono state fatte ad occhio per generare un modello semi casuale. Questo disegno di sequenza non ripetitiva non solo dovrebbe migliorare la stabilità della sequenza durante la propagazione in batteri, ma ha anche permesso la progettazione di primer PCR che annebbiato a regioni specifiche della sequenza.
Il costrutto Q80-GFP-v2A-GFP descritto sopra è stato sintetizzato commercialmente (Biomatik Corporation) (vedi file aggiuntivo 1) e sub-clonato attraverso i siti di restrizione BamHI e ClaI nel vettore di trasferimento genico Tol2 transposon-based, pT2AL200R150G (di seguito denominato Tol2) disponibile dal laboratorio Kawakami (Fig. 1a e vedi file aggiuntivo 2).
I costrutti PolyQ con un numero inferiore di ripetizioni di glutammina sono stati generati dall’amplificazione di esclusione basata sulla PCR del costrutto Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. I primer sono stati progettati per amplificare intorno al vettore escludendo un numero definito di ripetizioni di glutammina per generare i costrutti di interesse (Fig. 1d-f). Abbiamo mirato a generare vettori con circa 52 (Q52), 31 (Q31) e 10 (Q10) ripetizioni di glutammina. I vettori putativi Q52 e Q31 sono stati generati utilizzando lo stesso primer inverso accoppiato con diversi primer in avanti. Questo primer inverso comune ha amplificato 2 ripetizioni di glutammina, mentre i primer in avanti hanno amplificato le ulteriori 50 e 29 ripetizioni di glutammina necessarie per generare i vettori Q52 e Q31, rispettivamente. La posizione del primer inverso è stata leggermente spostata per ottimizzare l’amplificazione del vettore putativo Q10, in modo che il primer inverso ora amplifica 5 ripetizioni di glutammina mentre il primer forward amplifica le restanti 5 ripetizioni di glutammina (Fig. 1d-f). Utilizzando temperature di annealing rigorose nella reazione di PCR abbiamo ottenuto un legame specifico del primer. I prodotti PCR estratti dal gel e purificati sono stati fosforilati, circolarizzati per auto-legatura e successivamente trasformati in cellule competenti (vedi file aggiuntivo 3). La PCR utilizzando primer che fiancheggiavano la regione polyQ ha mostrato approssimativamente le dimensioni del prodotto previste per i vettori putativi Q52, Q31 e Q10 (Fig. 1g). I costrutti generati sono stati sequenziati per determinare se i numeri di ripetizione polyQ previsto erano presenti. Mentre il costrutto Q52 aveva il numero previsto di ripetizioni di glutammina (Fig. 2a, b), il sequenziamento ha rivelato discrepanze minori con i numeri previsti polyQ per gli altri due costrutti, dove il vettore Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP aveva 21-glutammina ripete (di seguito indicato come Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2c, d) e il vettore Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP aveva 11-glutamine ripetizioni (di seguito denominato Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2e, f). Ulteriori analisi hanno rivelato che la sequenza generata Q21 è stata derivata direttamente dalla sequenza originale e la perdita di ripetizioni di glutammina era dovuta al legame del primer Q31 forward 30 bp a valle del sito di legame previsto. Al contrario, la ripetizione aggiuntiva di glutammina nella sequenza Q11 è stata generata de novo, un’aggiunta di un codone CAA.
Mappa vettoriale e analisi della sequenza dei costrutti che codificano per Q52, Q21 e Q11-GFP generati mediante amplificazione per escissione basata su PCR. a Mappa vettoriale del costrutto Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP. b Cromatografia del costrutto Q52. c Mappa vettoriale del costrutto Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP. d Cromatografia del costrutto Q21. e Mappa vettoriale del costrutto Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP. f Cromatografia del costrutto Q11
Per studiare la cinetica di aggregazione e il ‘flusso autofagico’ della proteina polyQ in vivo, abbiamo iniettato i vettori polyQ generati (25 ng/μL) e l’mRNA della trasposasi (25 ng/μL) in gruppi di embrioni di zebrafish a uno stadio cellulare (Fig. 3a, b). Analisi Western blot con anticorpo anti-GFP di 24 ore dopo la fecondazione (hpf) lisati embrionali (10 embrioni per campione) è stato effettuato per ogni gruppo. Il vettore Tol2 vuoto (25 ng/μL) e l’mRNA della trasposasi (25 ng/μL) iniettati e non iniettati sono stati inclusi come controlli. Embrioni iniettati con i costrutti polyQ prodotto due bande rilevate dall’anticorpo anti-GFP come previsto; GFP attaccato al polyQ (polyQ80-GFP a ~ 48 kDa, polyQ52-GFP a ~ 38 kDa, polyQ21-GFP a ~ 33 kDa e polyQ11-GFP a ~ 31 kDa), e GFP libero (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Ognuno dei polyQ-GFP costrutto esprimendo lisati embrione ha anche mostrato una banda più debole di dimensioni proteiche superiori corrispondenti alla lunghezza completa polyQX-GFP-v2A-GFP costrutto (polyQ80-GFP-v2A-GFP a ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP a ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP a ~ 60 kDa, e polyQ11-GFP-v2A-GFP a ~ 58 kDa). Questa banda rappresenta il ~ 10% della proteina totale che viene tradotta come una singola proteina completa quando si usa il sistema di sequenza v2A. I rapporti Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP e Q11-GFP:GFP sono ~ 5, ~ 4, ~ 2 e ~ 1, rispettivamente (Fig. 3d). Poiché la sequenza v2A permette la traduzione stechiometrica delle proteine polyQ-GFP e GFP, in teoria il rapporto polyQ-GFP:GFP dovrebbe essere 1. I rapporti maggiori osservati possono indicare un accumulo di queste proteine. Queste osservazioni sono in accordo con la letteratura, dove è stato dimostrato che i costrutti di fusione polyQ-GFP contenenti più di 19 residui di glutammina si aggregano nelle cellule trasfettate in modo dipendente dalla lunghezza. Queste osservazioni ci portano a concludere che i nostri costrutti Tol2-QX-GFP-v2A-GFP forniscono un utile strumento per studiare il “flusso autofagico” in vivo in un modello larvale di zebrafish.
Analisi dell’espressione del costrutto Tol2-QX-GFP-v2A-GFP in D. rerio. Embrioni di zebrafish sono stati iniettati con 25 ng/µL del costrutto Tol2-QX-GFP-v2A-GFP e 25 ng/µL di mRNA che codifica per la trasposasi Tol2. a Brightfield (pannelli superiori) e fluorescente (pannelli inferiori) immagini della vista laterale sinistra della testa di zebrafish e regioni del tronco che esprimono Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Brightfield (pannelli in alto) e fluorescenti (pannelli in basso) le immagini della vista lato sinistro del tronco di zebrafish embrione e regioni della coda esprimendo Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Western blot analisi dell’espressione di Qx-GFP costrutti in D. rerio. Le proteine sono state isolate da embrioni ~ 24 hpf che esprimono i costrutti Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP. Le proteine sono state risolte su un gel SDS-PAGE al 10% e trasferite su una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata testata con un anticorpo anti-GFP. Il vettore Tol2 “vuoto” possiede un gene GFP espresso che viene sostituito durante l’inserimento del costrutto. d Quantificazione del Western blot. L’intensità GFP per ogni banda numerata del Western blot e il rapporto Qx-GFP a GFP libero sono presentati
Conclusione
In conclusione questo studio fornisce una soluzione robusta e facilmente adottabile per generare ripetizioni polyQ di lunghezza vicina a quella prevista. Al fine di generare un numero esatto di ripetizioni di glutammina, possono essere eseguiti cicli successivi di amplificazioni con sequenze di primer modificate. Inoltre la lunghezza del primer può essere aumentata per migliorare la specificità dell’annealing del primer sul modello. La nostra tecnica ha diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per l’amplificazione basata sulla PCR di regioni ripetitive e mira a ridurre al minimo la generazione di prodotti non specifici della PCR e di ripetizioni difettose sfruttando la ridondanza di codoni del codice genetico per generare una sequenza di codifica del DNA sinonimo con una ripetizione ridotta. Inoltre, il nostro approccio non si limita a generare sequenze di ripetizioni polyQ ma può essere generalizzato per generare altre sequenze di ripetizioni nucleotidiche. Inoltre, il nostro metodo è relativamente economico, poiché solo il costrutto iniziale polyQ80-GFP-v2A-GFP richiede una sintesi commerciale, il cui costo dipende dal prezzo per base nucleotidica, lunghezza, purezza e massa. Tutti gli altri materiali richiesti sono reagenti standard utilizzati per il clonaggio molecolare. In sintesi, la tecnica descritta fornisce una soluzione facile da adottare e conveniente per generare sequenze di DNA codificanti ripetute che possono essere manipolate come richiesto.