Nuovo mezzo di sovrapposizione a bassa viscosità per saggi di placche virali

Virus e cellule

Se non diversamente indicato, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando un isolato di virus influenzale clinico in cellule MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) gentilmente fornito dal Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) . I virus descritti in Fig. 5 sono stati gentilmente forniti dai colleghi elencati nella Acknowledgements.

Cellule MDCK e MDCK-SIAT1 cellule trasfettate stabilmente con 2,6-sialyltransferase per una maggiore espressione di Neu5Ac2-6Gal-terminati oligosaccaridi sono stati descritti in precedenza. Abbiamo propagato entrambi i tipi di cellule in DMEM (Gibco) integrato con 2 mM L-glutamina, 10% siero fetale di vitello e antibiotici (streptomicina, 100 mg/ml e penicillina, 100 U/ml).

Come mezzo di mantenimento liquido (MM) per l’infezione da virus, abbiamo usato MEM di Eagle contenente L-glutamina, 0,1% BSA (Sigma, A-0336), antibiotici e 1 μg/ml di tripsina TPCK (Sigma, T-1426).

Stocks di 1.8 % Bacto-Agar (BD, 214010) e 2% metilcellulosa (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s al 2%, Fluka) in acqua distillata sono stati preparati come descritto in precedenza.

Il produttore di Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) ha gentilmente fornito tre tipi di Avicel (RC-581, RC-591 e CL-661) per i test. Abbiamo preparato sospensioni stock di Avicel disperdendo 2,4 g di polvere Avicel in 100 ml di acqua distillata su un agitatore magnetico standard per 1 ora. Le scorte di Agar, MC e Avicel sono state sterilizzate in autoclave per 20 minuti a 121°C e conservate a temperatura ambiente.

Le sovrapposizioni sono state preparate mescolando soluzioni stock di MC, Avicel o agar fuso con volumi uguali di terreno di mantenimento a doppia resistenza. Per variare la concentrazione di MC e Avicel nelle sovrapposizioni, abbiamo diluito le scorte originali con acqua sterile. La sovrapposizione di agar è stata preparata a 42-44°C, altre due sovrapposizioni sono state preparate a 20 o 37°C.

Le scorte concentrate (2,4%) di Avicel in genere non si separavano durante la conservazione, le sovrapposizioni diluite a base di Avicel, tuttavia, erano meno stabili. Se ritenuto necessario, abbiamo mescolato le scorte Avicel, e sempre mescolato le sovrapposizioni Avicel prima dell’uso, agitando con la mano o con il vortex. La lenta separazione degli overlay dopo la loro applicazione sui monostrati cellulari non ha influenzato i risultati del test.

Saggio della placca in piastre da 6 pozzetti

Un’ora dopo aver infettato i monostrati cellulari con 30-50 unità formanti placche del virus in 1 ml di terreno di mantenimento senza tripsina, abbiamo rimosso l’inoculo del virus, coperto le cellule con 3 ml dei diversi media di overlay e incubato le culture a 35°C in atmosfera CO2 al 5%. Nel caso delle sovrapposizioni MC e Avicel, si è fatto attenzione a non disturbare le piastre durante il periodo di incubazione per evitare la formazione di placche non uniformi. Dopo tre giorni di incubazione, abbiamo rimosso gli overlay e fissato le cellule. La copertura di agar è stata rimossa usando una spatola metallica; le coperture MC, Avicel e liquide sono state rimosse mediante aspirazione. Le cellule sono state fissate con una soluzione di paraformaldeide al 4% in MEM per 30 minuti a 4°C e lavate con PBS. Tutti i successivi trattamenti delle cellule sono stati eseguiti a temperatura ambiente. Abbiamo permeabilizzato le cellule e contemporaneamente bloccato i gruppi aldeidici residui incubando le cellule per 10-20 min con 1 ml/pozzetto di soluzione contenente 0,5% Triton-X-100 e 20 mM glicina in PBS. Abbiamo immuno-macchiato le cellule infettate dal virus incubando per 1 ora con anticorpi monoclonali specifici per la nucleoproteina del virus dell’influenza A (gentilmente forniti dal Dr. Alexander Klimov al Centers for Disease Control, USA) seguiti da 1 ora di incubazione con anticorpi anti-mouse marcati con perossidasi (DAKO, Danimarca) e 30 minuti di incubazione con substrati di perossidasi che precipitano. Soluzione di 10% di siero di cavallo normale e 0,05% Tween-80 in PBS è stato utilizzato per la preparazione di diluizioni di lavoro di immuno-reagenti. Abbiamo lavato le cellule dopo gli anticorpi primari e secondari incubandole tre volte per 3-5 minuti con 0,05% Tween-80 in PBS. Come substrati di perossidasi, abbiamo impiegato True Blue™ pronto all’uso (KPL) o una soluzione di aminoetilcarbazolo (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) preparata in tampone di acetato di sodio 0,05 M, pH 5,5 e contenente lo 0,03% di H2O2. Le piastre colorate sono state lavate con acqua di rubinetto per fermare la reazione e asciugate. Nel caso della colorazione True Blue, che è relativamente instabile nelle soluzioni acquose, le piastre sono state asciugate invertite per ridurre al minimo lo sbiancamento. Le piastre colorate sono state scansionate su uno scanner a letto piatto e i dati sono stati acquisiti dal software Adobe Photoshop 7.0.

Come alternativa alla colorazione immunitaria, in alcuni esperimenti abbiamo rivelato le placche come aree di cellule distrutte. A tal fine, dopo aver rimosso le sovrapposizioni, abbiamo colorato le cellule con una soluzione di violetto di cristallo all’1% in metanolo al 20% in acqua.

Varianti della titolazione del virus in piastre a 96 pozzetti

1. Variante standard

Abbiamo infettato i monostrati di cellule MDCK o MDCK-SIAT1 in piastre da 96 pozzetti con 50 μl/pozzetto di diluizioni seriali del virus nel terreno di mantenimento senza tripsina. Dopo 1 h di incubazione a 35°C in 5% CO2, abbiamo rimosso il virus, aggiunto 100 μl/pozzetto di MC o Avicel media di sovrapposizione, e incubato le cellule per ulteriori 24 h per consentire la formazione di placche. Fissazione e immunocolorazione sono stati eseguiti come descritto sopra per le piastre da 6 pozzetti ma utilizzando 50 μl di reagenti per pozzetto.

2. Variante semplificata

Il test è stato eseguito esattamente come nella variante standard con le seguenti modifiche. Dopo 1 h di incubazione con il virus, non abbiamo rimosso l’inoculo. Abbiamo aggiunto 100 μl/pozzetto di media di sovrapposizione Avicel e mescolato la piastra battendo con la mano o utilizzando un mixer per piastre. I mezzi includevano quantità maggiori di tripsina (1,5 μg/ml) per compensare la diluizione della sovrapposizione con il materiale contenente il virus presente nei pozzetti.

Saggio di inibizione della placca

Noel Roberts (Roche Products, UK) ha gentilmente fornito l’inibitore della neuraminidasi oseltamivir carbossilato (OC). Abbiamo aggiunto 50 μl/pozzetto di diluizioni seriali 10 volte di OC nel mezzo di mantenimento senza tripsina (gamma di concentrazione da 4 nM a 400 μM OC) a monostrati di cellule MDCK-SIAT1 in piastre a 96 pozzetti. Abbiamo poi aggiunto 50 μl/pozzetto di diluizioni di virus (20-40 unità formanti placche per pozzetto). Abbiamo mescolato la piastra e l’abbiamo incubata per 1 h a 35°C per permettere l’inizio dell’infezione virale. Dopo di che, abbiamo aggiunto 100 μl/pozzetto di media di sovrapposizione Avicel 1,2% contenente 2 μg/ml di tripsina, incubato le culture per 24 h e fissate e immuno-colorate come descritto sopra.

Nel caso di piastre a 6 pozzetti, abbiamo aggiunto 0,75 ml aliquote del farmaco e dell’inibitore e 1,5 ml aliquota di Avicel per pozzetto e immuno-colorate le placche 3 giorni dopo l’infezione.