- Segnalazione attraverso il percorso intrinseco di apoptosi
- Mediatori mitocondriali dell’apoptosi caspasi-dipendente
- Citocromo c
- Smac/DIABLO
- Mediatori mitocondriali dell’apoptosi indipendente dalla caspasi
- Disruzione del percorso intrinseco nel cancro
- Segnalazione attraverso la via intrinseca nella terapia del cancro
- Strategie che mirano alla via intrinseca
- Proteine della famiglia Bcl-2
- Agonisti Smac/DIABLO
Segnalazione attraverso il percorso intrinseco di apoptosi
Nel percorso mitocondriale di apoptosi, l’attivazione della caspasi è strettamente legata alla permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna da parte dei membri proapoptotici della famiglia Bcl (Green e Kroemer, 2004). Numerosi stimoli citotossici e molecole produttrici di segnali proapoptotici convergono sui mitocondri per indurre la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (Decaudin et al., 1998; Green e Kroemer, 2004). Questa permeabilizzazione è regolata da proteine della famiglia Bcl-2, lipidi mitocondriali, proteine che regolano il flusso dei metaboliti bioenergetici e componenti del poro di transizione della permeabilità (Green e Kroemer, 2004). Alla rottura della membrana mitocondriale esterna, viene rilasciato un insieme di proteine che normalmente si trovano nello spazio tra la membrana mitocondriale interna e quella esterna, compresi il citocromo c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF e l’endonucleasi G (Saelens et al., 2004). Una volta nel citosol, queste proteine apoptogene innescano l’esecuzione della morte cellulare promuovendo l’attivazione delle caspasi o agendo come effettori di morte indipendenti dalle caspasi (Saelens et al., 2004).
Mediatori mitocondriali dell’apoptosi caspasi-dipendente
Citocromo c
Il rilascio del citocromo c dai mitocondri innesca direttamente l’attivazione della caspasi-3 attraverso la formazione del complesso apoptosoma contenente citocromo c/Apaf-1/caspase-9 (Cain et al., 2000). Una volta nel citosol, il citocromo c si lega alla regione C-terminale di Apaf-1, una proteina citosolica con un dominio N-terminale di reclutamento delle caspasi (CARD), un dominio di legame al nucleotide con omologia al CED-4 di Caenorhabditis elegans e un dominio C-terminale contenente 12-13 ripetizioni WD-40 (Zou et al., 1997). Il legame del citocromo c all’Apaf-1 facilita l’associazione del dATP con l’Apaf-1 ed espone la sua CARD N-terminale, che ora può oligomerizzare e diventare una piattaforma sulla quale la caspasi-9 iniziatrice viene reclutata e attivata attraverso un’interazione CARD-CARD (Adrain et al., 1999). Conseguentemente, la caspasi-3 è reclutata nell’apoptosoma, dove è attivata dalla caspasi-9 residente (Bratton et al., 2001). La caspasi-3 poi scinde substrati chiave nella cellula per produrre molti degli eventi cellulari e biochimici dell’apoptosi.
In certi casi, l’attività della caspasi istigata dal citocromo c citosolico contribuisce alla caduta della metalloproteinasi di matrice (MMP), come è stato dimostrato dall’uso di inibitori sintetici della caspasi e di cellule Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). Inoltre, l’attività della caspasi danneggia ulteriormente la funzione dei mitocondri permeabilizzati influenzando l’attività dei complessi I e II, portando inevitabilmente alla perdita della MMP e alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (Ricci et al., 2004). Così, gli eventi secondari risultanti dai cambiamenti citosolici, causati dal rilascio del citocromo c e di altre proteine mitocondriali IMS, possono alimentare di nuovo i mitocondri permeabilizzati e influenzare la loro funzione. Inoltre, questo ciclo di amplificazione mitocondriale dell’attività della caspasi può determinare criticamente la risposta delle cellule tumorali ai trattamenti citotossici.
Inoltre, ci sono prove recenti dell’esistenza di un meccanismo di attivazione della caspasi indipendente dal citocromo c e dall’apoptosoma, ma dipendente da Apaf-1. Un knock-in mirato di una variante del citocromo c che manca di proprietà apoptogene, ma ha attività di trasferimento di elettroni e antiossidante (K72A), ha permesso di valutare il contributo del citocromo c all’apoptosi senza influenzare la sua funzione nella fosforilazione ossidativa (Hao et al., 2005). È interessante notare che i timociti dei topi KA/KA erano marcatamente più sensibili agli stimoli di morte tra cui etoposide e γ-irradiazione rispetto ai timociti Apaf-1(-/-) (Hao et al., 2005). Dopo il trattamento con γ-irradiazione, le procaspasi sono state efficacemente attivate nei timociti KA/KA apoptotici, ma l’oligomerizzazione di Apaf-1 non è stata osservata (Hao et al, 2005) indicando un requisito differenziale per il citocromo c e Apaf-1 nell’apoptosi.
Smac/DIABLO
Altre proteine rilasciate dai mitocondri, come Smac/DIABLO e Omi/HtrA2, facilitano l’attivazione delle caspasi neutralizzando gli inibitori endogeni delle caspasi, le proteine inibitrici dell’apoptosi (IAPs). Smac e il suo omologo murino DIABLO sono proteine mitocondriali codificate a livello nucleare, che contengono un segnale di localizzazione mitocondriale, che viene rimosso proteoliticamente durante l’importazione mitocondriale per produrre la proteina matura di 23 kDa (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Questa fase di maturazione espone il motivo di legame IAP (IBM) all’N-terminale di Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (Tabella 1). Il secondo attivatore derivato dai mitocondri della caspasi/DIABLO ha dimostrato di legarsi a XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin e Apollon in modo BIR-dipendente (Vaux e Silke, 2003) (Figura 2), e agisce come omodimero con l’IBM presente in una configurazione bivalente (Chai et al., 2000). Un dimero Smac/DIABLO lega una molecola di XIAP da entrambi i motivi di legame IAP, uno interagendo con BIR2 e l’altro con BIR3 (Huang et al., 2003). Intrigante, lo stesso solco BIR3 lega l’IBM esposto al N-terminale (Ala-Thr-Pro-Phe) della piccola subunità della caspasi-9 in seguito alla sua elaborazione autocatalitica dopo Asp315, permettendo a Smac/DIABLO di spostare la caspasi-9 da XIAP (Srinivasula et al, 2001) (Tabella 1).
La funzione mitocondriale fisiologica di Smac/DIABLO è sconosciuta, e i topi DIABLO -/- sembrano normali (Okada et al., 2002). Anche se la scissione in vitro della procaspasi-3 su aggiunta di citocromo c è stata inibita nei lisati di cellule Smac -/-, i topi e le cellule Smac -/- hanno risposto normalmente a stimoli apoptotici come l’irradiazione UV, la staurosporina, l’etoposide e il TNF/cicloesamide (Okada et al., 2002). Queste osservazioni suggeriscono l’esistenza di fattori ridondanti che compensano la perdita di Smac/DIABLO, probabilmente HtrA2/OMI.
Omi/HtrA2 è una proteina codificata a livello nucleare, 49 kDa con un segnale di localizzazione mitocondriale N-terminale che media la sua traslocazione nello spazio intermembrana mitocondriale (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 viene elaborato nello spazio intermembrana nella forma matura da 37 kDa, liberando un IBM al suo N-terminale (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabella 1). Sebbene l’Omi/HtrA2 ricombinante possa catalizzare la propria maturazione in vitro, la proteasi responsabile della sua maturazione nelle cellule rimane sconosciuta (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 gioca un ruolo essenziale nella regolazione dell’omeostasi mitocondriale che richiede la sua attività proteolitica, sebbene i bersagli molecolari e i partner di interazione di Omi/HtrA2 nel mitocondrio non siano ancora stati definiti (Saelens et al., 2004). Una volta che Omi/HtrA2 viene rilasciato dai mitocondri nel citosol, promuove la morte cellulare in modo caspasi-dipendente antagonizzando le IAP, e in modo caspasi-indipendente come proteasi (Saelens et al., 2004). Simile a Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 blocca le IAP attraverso il suo motivo N-terminale di legame alle IAP, presentato in una configurazione trimerica (Li et al., 2002)
Anche se il rilascio del citocromo c nel citosol innesca direttamente l’attivazione della caspasi-3 attraverso la formazione del complesso apoptosoma contenente citocromo c/Apaf-1/caspase-9, Smac/DIABLO e Omi/HtrA2 promuovono indirettamente l’attivazione della caspasi antagonizzando gli effetti inibitori delle IAP (Saelens et al., 2004). Quindi, esiste un equilibrio dinamico tra le molecole effettrici pro- e antiapoptotiche, che permette alla cellula di far fronte a un danno mitocondriale limitato, nel qual caso le IAPs possono bloccare adeguatamente l’attivazione della caspasi iniziata da una piccola quantità di citocromo c rilasciato. Tuttavia, in circostanze in cui il danno mitocondriale procede o colpisce simultaneamente più mitocondri, l’ostacolo antiapoptotico imposto dalle IAPs può essere superato dalla maggiore concentrazione citosolica dei loro antagonisti Smac/DIABLO e HtrA2/OMI, che neutralizzano le IAPs per legame diretto.
C’è una crescente evidenza che le cellule tumorali hanno una spinta intrinseca all’apoptosi che è tenuta sotto controllo dalle IAPs. A questo scopo, alti livelli basali di attività di caspasi-3 e caspasi-8 e frammenti di caspasi-3 attivi in assenza di apoptosi sono stati rilevati in varie linee cellulari tumorali e tessuti tumorali, ma non in cellule normali (Yang et al., 2003a). Le cellule tumorali, ma non quelle normali, hanno anche espresso alti livelli di IAPs, suggerendo che l’espressione di IAPs upregolata ha contrastato l’alta attività basale della caspasi selettivamente nelle cellule tumorali (Yang et al., 2003a). Pertanto, le strategie che hanno come obiettivo le IAP sono considerate un approccio promettente per migliorare l’efficacia delle terapie citotossiche in modo selettivo nelle cellule tumorali. A tal fine, la trasfezione-espressione forzata di Smac/DIABLO ha abbassato la soglia per l’uccisione indotta da TRAIL in diversi tumori (Ng e Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) e ha anche sensibilizzato le cellule tumorali alla chemioterapia (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Tuttavia, la traslocazione di Smac/DIABLO endogeno nel citosol durante l’apoptosi indotta da farmaci antitumorali non sembra giocare un ruolo importante in certe condizioni, per esempio, in cellule di carcinoma polmonare umano dopo il trattamento con etoposide (Bartling et al., 2004). La downregolazione di Smac/DIABLO tramite small interfering RNA (siRNA) non ha influenzato l’uccisione da etoposide in queste cellule, anche se un peptide Smac-N7 che lega IAP ha migliorato l’apoptosi indotta da etoposide (Bartling et al., 2004). Questi dati suggeriscono che la carenza di Smac/DIABLO può essere compensata dall’azione di determinanti ridondanti in alcune cellule tumorali.
Mediatori mitocondriali dell’apoptosi indipendente dalla caspasi
Su rilascio dallo spazio intermembrana mitocondriale, HtrA2/OMI contribuisce alla morte cellulare anche in modo indipendente dalla caspasi come proteasi oltre a promuovere l’apoptosi in modo caspasi-dipendente antagonizzando le IAP (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Dati in vitro hanno dimostrato la degradazione di XIAP, cIAP1, cIAP2 e Apollon da parte dell’attività proteasica di HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Inoltre, Trencia et al. (2004) hanno dimostrato l’interazione dell’antiapoptotico PED/PEA-15 con, e la sua degradazione da parte di, HtrA2/OMI citosolico. La diminuzione dei livelli di HtrA2/OMI nelle cellule tramite antisenso o interferenza RNA abbassa la sensibilità di diverse linee cellulari di cancro alla morte cellulare indotta da staurosporina, Fas, UV o cisplatino (Martins et al., 2002).
Inoltre, l’AIF e l’endonucleasi G vengono rilasciati dai mitocondri al momento della permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e si spostano nel nucleo per contribuire alla condensazione della cromatina nucleare e alla frammentazione del DNA su larga scala (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Se queste due proteine siano rilasciate prima, insieme o dopo il citocromo c è stato discusso in modo controverso (Arnoult et al., 2002). Inoltre, non è ancora esattamente chiaro come l’AIF contribuisca alla frammentazione del DNA nucleare, dato che manca di attività DNasica intrinseca. Nelle cellule di mammifero, la ciclofilina A, una peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, coopera con l’AIF per indurre la rottura del DNA (Cande et al., 2004).
Disruzione del percorso intrinseco nel cancro
Mutazioni nei geni coinvolti nella regolazione del percorso mitocondriale sono molto comuni nelle cellule tumorali. Poiché la maggior parte delle terapie antitumorali inducono l’apoptosi nelle cellule tumorali innescando la via intrinseca, tali mutazioni sono solitamente associate alla resistenza al trattamento. Per esempio, la sovraespressione di Bcl-2, come risultato della traslocazione cromosomica dell’oncogene bcl-2 nel locus del gene della catena pesante dell’immunoglobulina, è associata a circa l’85% del linfoma follicolare umano (Tsujimoto et al., 1984). Esperimenti con topi transgenici hanno dimostrato che la sovraespressione di Bcl-2 può promuovere la trasformazione neoplastica dei linfociti B e T e delle cellule mieloidi (McDonnell e Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998). Tuttavia, poiché Bax e Bak hanno ruoli largamente sovrapposti nell’apoptosi, è stato difficile determinare se questa ipotesi è vera e infatti i topi bax-/- non sono marcatamente predisposti alla neoplasia (Knudson et al., 2001). Tuttavia, mutazioni somatiche che inattivano il gene bax sono state trovate in alcuni tumori solidi e neoplasie ematologiche. A questo proposito, sono state descritte mutazioni di sostituzione di un singolo nucleotide o frameshift, che inattivano il gene Bax nel cancro del colon con mismatch repair-deficient (MMR) o nei tumori maligni ematopoetici (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).
Inoltre, ci sono sempre più prove che le proteine BH3-only possono contribuire alla soppressione della trasformazione maligna, indicando che possono funzionare come soppressori tumorali in buona fede. Per esempio, è stato dimostrato che la perdita di un singolo allele di Bim accelera la linfomagenesi delle cellule B indotta dall’espressione di un transgene c-myc (Egle et al., 2004), in linea con il ruolo chiave di Bim come regolatore dell’omeostasi linfoide (Strasser, 2005). È interessante notare che delezioni omozigoti nella regione cromosomica che ospita il gene bim sono state recentemente identificate in pazienti con linfoma mantellare (Tagawa et al., 2005). I topi privi di bim sviluppano spontaneamente un disordine mieloproliferativo che può progredire verso una malignità simile alla leucemia mielomonocitica cronica (CMML) (Zinkel et al., 2003). Inoltre, è stato riportato che la soppressione mediata da RNAi di Puma accelera la linfomagenesi indotta da Myc (Hemann et al., 2004).
Oltre alle alterazioni genetiche, l’espressione aberrante delle proteine della famiglia Bcl-2 è principalmente regolata a livello trascrizionale o post-trascrizionale. Per esempio, l’espressione di diverse proteine antiapoptotiche della famiglia Bcl-2, per esempio Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 o Bfl-1, è regolata trascrizionalmente da NF-κB (Cory e Adams, 2002).
Oltre alle proteine della famiglia Bcl-2, un’attività ridotta o assente di Apaf-1 è stata trovata nel cancro ovarico, nel melanoma e nella leucemia. Inoltre, le mutazioni nel gene soppressore del tumore p53, il difetto genetico più comune nei tumori umani, influiscono sul percorso intrinseco. Per esempio, l’attivazione di p53 upregola un certo numero di geni che possiedono elementi p53-responsive presenti nei loro promotori, come le proteine proapoptotiche BH3-only Puma, Noxa e Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Di conseguenza, le cellule in cui p53 è stabilizzata sono sensibilizzate all’attivazione della via di morte cellulare mitocondriale. Inoltre, p53 può influenzare direttamente l’integrità mitocondriale senza la necessità di un’attivazione genica. Infatti, è stato riportato che p53 può legarsi a Bcl-2 e Bcl-XL nei mitocondri, promuovendo così la destabilizzazione mitocondriale (Mihara et al, 2003).
Segnalazione attraverso la via intrinseca nella terapia del cancro
La maggior parte degli agenti chemioterapici convenzionali, per esempio, etoposide, doxorubicina, cisplatino o paclitaxel, provocano la permeabilizzazione mitocondriale in modo indiretto innescando perturbazioni del metabolismo intermedio o aumentando la concentrazione di secondi messaggeri pro apoptotici, per esempio, inducendo l’espressione di p53, inducendo il percorso ceramide/GD3, inducendo il sistema ligando CD95/CD95L, influenzando le proteine Bcl-2-like e/o compromettendo l’equilibrio redox o energetico.
Ci sono sempre più prove dell’esistenza di un cross-talk nucleo-mitocondriale dopo un danno al DNA. Per esempio, i segnali apoptotici derivanti dal danno al DNA possono essere trasmessi attraverso il soppressore tumorale p53 ai mitocondri, che a loro volta rilasciano fattori apoptogeni nel citoplasma che attivano programmi di distruzione a valle (Moll et al., 2005). p53 può coinvolgere indirettamente il percorso mitocondriale attivando trascrizionalmente l’espressione delle proteine proapoptotiche Bcl-2, per esempio, Bid, Puma o Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Inoltre, p53 può innescare direttamente la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna in modo indipendente dalla trascrizione attraverso l’attivazione diretta delle proteine Bcl-2 proapoptotiche Bax o Bak o attraverso il legame e l’inattivazione delle proteine Bcl-2 antiapoptotiche come Bcl-2 o Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la p53 mirata al mitocondrio possiede attività di soppressione tumorale anche in vivo (Talos et al., 2005).
Inoltre, la caspasi-2 possiede la capacità di coinvolgere la via apoptotica mitocondriale in risposta al danno al DNA permeabilizzando la membrana mitocondriale esterna e/o rompendo l’associazione del citocromo c con la membrana mitocondriale interna. Quindi, le cellule trasfettate in modo stabile con procaspase-2 antisenso, o che esprimono transitoriamente siRNA, erano refrattarie al rilascio di citocromo c e a vari eventi a valle, come l’attivazione delle caspasi e la frammentazione del DNA, indotti dal danno al DNA (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). La caspasi-2 può agire indirettamente sui mitocondri, per esempio, scindendo la proteina proapoptotica Bid, seguita dalla sua traslocazione nei mitocondri per indurre il rilascio del citocromo c (Guo et al., 2002). Inoltre, la caspasi-2 può permeabilizzare direttamente la membrana mitocondriale esterna e stimolare il rilascio di citocromo c e Smac/DIABLO, probabilmente come risultato dell’interazione diretta della caspasi-2 processata con proteine putative e/o fosfolipidi situati nella membrana mitocondriale esterna, o in siti di contatto tra la membrana esterna e quella interna (Robertson et al., 2004). La permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna richiede l’elaborazione dello zimogeno della caspasi-2 ma non l’attività proteolitica associata e avviene indipendentemente da diverse proteine della famiglia Bcl-2, tra cui Bax, Bak e Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Inoltre, è stato dimostrato che la caspasi-2 ha anche la sorprendente capacità di interrompere l’associazione tra il citocromo c e i fosfolipidi anionici, in particolare la cardiolipina, rendendo così disponibile un ulteriore citocromo c per il rilascio nel citosol (Enoksson et al., 2004). Dopo un danno al DNA, è stato recentemente riportato che la caspasi-2 si attiva nel cosiddetto PIDDosoma, un complesso della proteina PIDD, induttiva della p53 e contenente il dominio della morte, della caspasi-2 e della proteina adattatrice RAIDD (Tinel e Tschopp, 2004), indicando l’esistenza di una via apoptotica nucleo-mitocondriale.
Inoltre, è stato riportato che l’istone H1.2 gioca un ruolo importante nella trasmissione di segnali apoptotici dal nucleo ai mitocondri in seguito a rotture del doppio filamento di DNA (Konishi et al., 2003). L’istone nucleare H1.2 viene rilasciato nel citoplasma attraverso un meccanismo p53-dipendente dopo le rotture del doppio filamento di DNA e induce il rilascio del citocromo c dai mitocondri isolati in modo Bak-dipendente (Konishi et al., 2003). La riduzione dell’espressione di H1.2 ha aumentato la resistenza cellulare all’apoptosi indotta dall’irradiazione di raggi X o dall’etoposide (Konishi et al., 2003).
Inoltre, il recettore nucleare orfano Nur77 (conosciuto anche come TR3) è stato recentemente accoppiato al macchinario apoptotico Bcl-2 nei mitocondri (Lin et al., 2004). Il legame di Nur77 alla regione del loop N-terminale di Bcl-2, situata tra i suoi domini BH4 e BH3, induce un cambiamento conformazionale di Bcl-2 che espone il suo dominio BH3, con conseguente conversione di Bcl-2 da protettore a killer (Lin et al., 2004). È interessante notare che livelli elevati di un membro della famiglia Nur77 sono stati associati a risposte favorevoli agli agenti chemioterapici nei pazienti (Shipp et al., 2002).
Inoltre, in seguito a stress cellulare, compresi i farmaci chemioterapici, specifici membri della famiglia Bcl-2 proapoptotici sono attivati, derepressi o indotti, e quindi agiscono come sensori. L’attività delle proteine BH3-only è tenuta sotto controllo da diversi meccanismi, mantenendo queste proteine lontane dalle controparti Bcl-2 multidominio in circostanze normali, ma permettendo la loro rapida attivazione in condizioni di stress (Bouillet e Strasser, 2002). Come menzionato sopra, le proteine della famiglia Bcl-2 come Bid, Puma o Noxa sono sotto il controllo trascrizionale del soppressore tumorale p53 e quindi, upregolate in risposta ad agenti dannosi per il DNA (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). La proteina BH3-only Bim, che è associata al citoscheletro legandosi ai microtubuli, è liberata e attiva la via intrinseca dopo il trattamento con taxolo, che agisce sull’assemblaggio dei microtubuli (Sunters et al., 2003). Recentemente, è stato dimostrato che il paclitaxel induce l’accumulo di Bim e l’apoptosi Bim-dipendente nei tumori epiteliali in vitro e anche in vivo (Tan et al., 2005). Le proteine BH3 attive legano e contrastano quelle antiapoptotiche e in alcuni casi attivano i membri della famiglia Bcl-2 proapoptotici multidominio, portando alla perdita di permeabilità della membrana mitocondriale (Bouillet e Strasser, 2002). Il modo in cui le proteine Bcl-2 inducono il disturbo della membrana esterna mitocondriale è ancora oggetto di dibattito e può coinvolgere la capacità di formazione dei pori e di auto-oligomerizzazione di alcune proteine della famiglia Bcl-2, la modulazione del poro di transizione della permeabilità mitocondriale da parte delle proteine della famiglia Bcl-2 e/o cambiamenti lipidici e interazioni tra proteine lipidiche all’interno delle membrane mitocondriali. Inoltre, agenti chemioterapici come il paclitaxel causano l’iperfosforilazione e l’inattivazione di Bcl-2 e, contemporaneamente, favoriscono l’apertura del poro di transizione della permeabilità (PT) (Ruvolo et al., 2001).
I farmaci chemioterapici possono anche indurre o facilitare la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna attraverso cambiamenti nei potenziali redox cellulari a causa di una maggiore generazione di specie reattive dell’ossigeno (o una diminuzione della loro detossificazione), esaurimento del glutatione ridotto o esaurimento del NADPH, poiché il megacanale mitocondriale possiede diversi siti sensibili al redox (Debatin et al., 2002). Inoltre, i cambiamenti nel metabolismo energetico, per esempio la deplezione di ADP e ATP, potrebbero facilitare l’apertura del complesso dei pori di transizione della permeabilità (PTPC), poiché l’ADP e l’ATP sono i ligandi fisiologici del traslocatore dell’adenina nucleotide, che funzionano come inibitori endogeni del PTPC (Costantini et al., 2000). Inoltre, il disaccoppiamento o l’inibizione della catena respiratoria o l’alcalinizzazione della matrice possono favorire la permeabilizzazione della membrana mitocondriale. Inoltre, messaggeri lipidici come la ceramide, che è generata in cellule esposte a diversi stimoli che inducono l’apoptosi, compresi i farmaci citotossici, possono contribuire alla permeabilizzazione della membrana mitocondriale (Susin et al., 1997). Ad alte concentrazioni, alcuni farmaci chemioterapici, per esempio, etoposide o paclitaxel, possono anche indurre la permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale in mitocondri isolati (Robertson et al., 2000; Kidd et al, 2002).
Inoltre, un numero crescente di farmaci anticancro sperimentali, tra cui l’arsenito, la lonidamide, il retinoide sintetico CD437 o il prodotto naturale acido betulinico, hanno dimostrato di agire direttamente sui mitocondri (Debatin et al., 2002). Per esempio, è stato riportato che l’acido betulinico scatena l’apoptosi inducendo direttamente la perdita del potenziale di membrana mitocondriale in mitocondri isolati in un modo che non è influenzato dall’inibitore della caspasi Z-VAD-fmk e tuttavia è inibito dal BA, un inibitore del PTPC, o da Bcl-2 e Bcl-XL (Fulda et al,
Strategie che mirano alla via intrinseca
Proteine della famiglia Bcl-2
Siccome le proteine antiapoptotiche Bcl-2, che bloccano potentemente la via intrinseca dell’apoptosi, si trovano a livelli elevati nei tumori umani sia di origine ematologica che non ematologica (Cotter, 2004), esse rappresentano obiettivi promettenti per interventi terapeutici. Di conseguenza, sono state sviluppate diverse strategie per colpire le proteine Bcl-2, per esempio, tecniche antisenso, peptidi del dominio BH3 o farmaci sintetici a piccole molecole che interferiscono con la funzione della proteina Bcl-2-like. Per downregolare l’espressione di Bcl-2, Bcl-2 antisenso oligonucleotidex (genasense) sono stati sviluppati da Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense è un sintetico, 18-base, oligonucleotide fosforotioato a singolo filamento che si rivolge selettivamente ai primi sei codoni (cioè, 18 basi) della struttura di lettura aperta dell’mRNA che codifica la proteina Bcl-2 (Cotter, 2004). Il trattamento con il genasense ha aumentato notevolmente l’attività antitumorale di molti farmaci chemioterapici, per esempio, taxani, antracicline, alchilanti o agenti contenenti platino (Cotter, 2004). In un modello preclinico di melanoma, il pretrattamento con genasense ha aumentato la chemiosensibilità del melanoma umano (Jansen et al., 1998). Anche in uno studio clinico, è stato riportato che il genasenso ha agito come chemiosensibilizzatore per la dacarbazina in pazienti con melanoma maligno (Jansen et al., 2000). Per ottimizzare la terapia basata sull’antisenso, sono stati successivamente progettati oligonucleotidi antisenso bispecifici diretti contro una sequenza che è altamente omologa in Bcl-2 e Bcl-xL, ma mancante nell’mRNA di Bcl-xS (Zangemeister-Wittke et al., 2000). La downregolazione simultanea sia di Bcl-2 che di Bcl-xL ha indotto l’apoptosi e una maggiore chemiosensibilità in varie cellule tumorali (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).
Inoltre, sono stati sviluppati peptidi del dominio BH3 o inibitori sintetici di piccole molecole per colpire le proteine anti-apoptotiche Bcl-2-like. Il dominio BH3 comprende un’α-elica anfipatica di nove amminoacidi che si lega a una tasca idrofobica delle proteine Bcl-2-like (Cory e Adams, 2002). Allo stesso modo, i peptidi del dominio BH3 mirano a interrompere questo complesso, sensibilizzando così le cellule tumorali all’apoptosi (Letai et al., 2002). Inoltre, la sostituzione del dominio BH3 di Bid con aminoacidi non naturali sulla superficie opposta alla regione di interazione mediante pinzatura di idrocarburi ha portato a peptidi BH3 stabilizzati denominati SAHBs (α-elica stabilizzata dei domini Bcl-2), con migliori proprietà farmacologiche (Walensky et al., 2004). Questi peptidi stabilizzati BH3 hanno innescato l’apoptosi in una varietà di linee cellulari leucemiche e hanno anche inibito la crescita di xenotrapianti leucemici nei topi senza effetti collaterali negativi (Walensky et al., 2004).
Inoltre, sono stati identificati diversi composti di piccole molecole che interferiscono con la funzione Bcl-2/Bcl-xL. Lo screening di una libreria chimica per composti capaci di legarsi alla tasca BH3 delle proteine Bcl-2 ha portato all’identificazione di HA14-1, un composto che compete con Bak per il legame a Bcl-2 (Wang et al., 2000). Esaminando una libreria di 16 320 composti preselezionati per la capacità di spostare un peptide fluorescente Bak BH3 da Bcl-xL in un saggio di polarizzazione fluorescente, Degterev et al. (2003) hanno identificato due classi di agenti chiamati inibitori BH3 (BH3Is), che interrompono anche il complesso Bcl-xL con Bax e Bad in cellule intatte.
Utilizzando lo screening basato sulla risonanza magnetica nucleare (NMR), la sintesi parallela e il design basato sulla struttura, è stato recentemente scoperto un inibitore di piccole molecole delle proteine antiapoptotiche Bcl-2, Bcl-X(L) e Bcl-w, ABT-737. ABT-737 è stato efficace come agente singolo contro alcuni linfomi e tumori solidi e ha mostrato una citotossicità sinergica con chemioterapici e radiazioni (Oltersdorf et al., 2005).
Agonisti Smac/DIABLO
Per la progettazione di piccole molecole potenzialmente terapeutiche per colpire XIAP, il solco di legame del dominio BIR3 di XIAP, al quale Smac/DIABLO si lega dopo il suo rilascio dai mitocondri, ha attirato la maggior parte dell’attenzione. L’analisi strutturale ha fornito un chiaro razionale per la sintesi di piccoli composti che possono mimare l’attività di spostamento della caspasi-9 di Smac/DIABLO dal BIR3 di XIAP (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Per migliorare la consegna intracellulare, i peptidi Smac sono stati collegati a un vettore, per esempio, il motivo di trasduzione della proteina Tat dell’HIV (Fulda et al., 2002), la sequenza penetratina della Drosophila antennapaedia (Arnt et al., 2002) o un tratto di poliarginina (Yang et al., 2003b). Un eptapeptide che rappresenta l’N-terminale di Smac/DIABLO maturo, che è essenziale per il legame a XIAP, è stato riportato per promuovere l’attivazione della caspasi e per sensibilizzare varie linee cellulari tumorali e anche cellule tumorali primarie derivate da pazienti per l’apoptosi indotta dalla legatura del recettore della morte o da farmaci citotossici (Fulda et al., 2002). È importante notare che i peptidi Smac hanno anche migliorato l’attività antitumorale di TRAIL in vivo in un modello di xenotrapianto di glioma maligno intracranico (Fulda et al., 2002b). Allo stesso modo, un peptide di 8-mer (AVPIAQKS) fuso al dominio di trasduzione della proteina della penetratina della Drosophila antennapaedia è stato in grado di entrare nelle cellule del cancro al seno, legare XIAP e cIAP1, e potenziare l’attività della caspasi indotta da una serie di farmaci antitumorali, tra cui paclitaxel, etoposide, 7-etil-10-idrossicamptothecin (SN-38) e doxorubicina (Arnt et al., 2002). Inoltre, sulla base della struttura tridimensionale di Smac/DIABLO in complesso con XIAP BIR3, sono stati progettati peptidomimetici Smac, che hanno cooperato con TRAIL, TNFα, cisplatino o etoposide per innescare l’apoptosi nelle cellule tumorali (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).
Successivamente, antagonisti non peptidici di piccole molecole di XIAP, che sono stati derivati dallo screening di una libreria di fagi o di polifenilurea, sono stati sviluppati per il targeting di IAPs (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Inoltre, il prodotto naturale embelina dall’erba giapponese Ardisia è stato recentemente scoperto come un inibitore permeabile alle cellule, non peptidico, di piccolo peso molecolare di XIAP attraverso lo screening computazionale basato sulla struttura di un database di strutture tridimensionali di medicina tradizionale (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Embelin ha dimostrato di superare efficacemente l’effetto protettivo di XIAP in cellule di cancro alla prostata con alti livelli endogeni di XIAP o in cellule Jurkat trasfettate con XIAP attraverso il legame al dominio XIAP BIR3 (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Quindi, gli agonisti Smac o gli antagonisti XIAP a basso peso molecolare possono essere candidati promettenti per la terapia del cancro, potenziando l’efficacia delle terapie citotossiche in modo selettivo nelle cellule tumorali.