Pratica per la genetica umana Vienna

Ricerca su tutto il genoma di microaberrazioni: Array-CGH

Sono note da tempo le sindromi complesse basate sulla moltiplicazione o riduzione del materiale cromosomico. Nella trisomia 21, per esempio, un cromosoma completo è presente tre volte invece di due. Nelle sindromi da microdelezione come la sindrome di Williams-Beuren, Prader-Willi o Smith-Magenis, mancano sezioni più o meno definite di un cromosoma, di solito su una scala submicroscopica di qualche megabase. Nel caso di malattie monogenetiche, delezioni o duplicazioni di singoli geni o segmenti genici sono stati recentemente scoperti con sempre maggiore frequenza come causa della malattia.

Le tecniche utilizzate fino ad oggi nella diagnosi di tali cambiamenti di dosaggio genico hanno i loro limiti: Per esempio, anche se i metodi di citogenetica molecolare come il FISH o i metodi di genetica molecolare come l’MLPA possono essere utilizzati con alta o altissima risoluzione, devono sapere o assumere a priori quale area del genoma è interessata. D’altra parte, la citogenetica classica o la tecnica CGH (‘comparative genomic hybridisation’: L’ibridazione comparativa del DNA del paziente e del DNA di riferimento sui cromosomi in metafase) può coprire l’intero genoma, ma la risoluzione è limitata a circa 5 Mb nel migliore dei casi a causa dell’uso del microscopio ottico.

Per superare queste limitazioni delle tecniche esistenti, l’array CGH è un’alternativa adatta.

Qui, la tecnica CGH convenzionale è combinata con l’esperienza acquisita dall’analisi di espressione utilizzando microarray: Frammenti definiti di DNA immobilizzati sulla superficie di un vetrino servono come bersagli di ibridazione, dove il termine “array” si riferisce alla disposizione regolare e a griglia di questi frammenti. I frammenti sono selezionati per coprire il genoma umano nel modo più uniforme possibile.

Per l’analisi, quantità approssimativamente uguali del DNA del paziente e di un DNA genomico di riferimento sono coibridati sulla matrice. Poiché i campioni di DNA del paziente e di riferimento sono etichettati con diversi coloranti fluorescenti, un cambiamento numerico nel genoma del paziente porta a uno spostamento di colore nel segnale fluorescente dei singoli frammenti attraverso uno spostamento del rapporto di ibridazione.

Rappresentazione schematica della tecnica CGH dell’array:

in scanner rileva i segnali fluorescenti e registra gli spostamenti di colore. Con il software appropriato, i segnali vengono assegnati alla regione del gene e infine il risultato può essere visualizzato, ad esempio come un “cariogramma”, che mostra in quale punto di un cromosoma sono presenti cambiamenti.

Visualizzazione di un risultato dell’array CGH: duplicazione della regione Xp11-p21.1 (creata allo ZMG con CGHAnalytics, Agilent)

Il numero e la densità dei frammenti sull’array determinano la risoluzione dell’array CGH. Attualmente, sono disponibili array con copertura dell’intero genoma umano a risoluzioni che vanno da 1 Mb fino a circa 35 kb. A causa del numero sempre crescente di frammenti per array, la risoluzione continuerà ad aumentare. Così, gli squilibri dei singoli geni possono essere rilevati in modo affidabile.

Applicazioni di array CGH

Array CGH è quindi una tecnica in cui il genoma completo di un paziente può essere esaminato ad alta risoluzione per deviazioni dal normale dosaggio genico. Sta diventando sempre più importante come metodo di screening innovativo, anche se è stato inizialmente utilizzato soprattutto nella diagnostica dei tumori. Questo perché la progressione del tumore è caratterizzata da un accumulo di aberrazioni che possono essere accompagnate dall’amplificazione di oncogeni e dalla cancellazione di geni soppressori del tumore.

ArrayCGH è di particolare interesse per la diagnosi dei casi di ritardo mentale inspiegabile. Nella citogenetica standard, le aberrazioni sono visibili in circa il 5% dei casi in pazienti con ritardo mentale e segni aggiuntivi di dismorfia o raggruppamento familiare. Lo screening dei subtelomeri con FISH o MLPA può trovare una causa in un ulteriore 5% dei casi. Studi recenti mostrano che l’array CGH con una risoluzione di circa 1 Mb rivela squilibri genomici nel 10-15% dei pazienti con un cariotipo poco appariscente e risultati negativi dei subtelomeri. (vedi letteratura). Si presume che questo tasso di rilevamento aumenterà con l’aumentare della risoluzione degli array. Alcuni gruppi di ricerca raccomandano già l’array CH come primo passo diagnostico nei casi di ritardo mentale inspiegabile.

Tuttavia, l’array CH non solo rileva nuovi squilibri, ma può anche essere utilizzato per determinare con precisione la dimensione della delezione, la posizione dei punti di rottura o l’origine del materiale aggiuntivo nei casi di perdita o guadagno di regioni cromosomiche citogeneticamente visibili. Questo è importante per un’accurata correlazione genotipo-fenotipo e per identificare i geni candidati coinvolti nello sviluppo della MR e della dismorfia. In alcune anomalie cromosomiche precedentemente trovate come traslocazioni “bilanciate”, l’array CGH è stato in grado di dimostrare che il materiale genetico è cancellato o duplicato nella regione dei breakpoint e quindi è presente una traslocazione sbilanciata. Così, con l’aiuto dell’array CGH, i risultati citogenetici sono resi più precisi e corretti.

Quindi, mentre i confini tra citogenetica e genetica molecolare stanno diventando sempre più sfumati, la cariotipizzazione rimane importante perché alcune alterazioni cromosomiche non sono rilevabili con l’array CGH: Poliploidie, vere traslocazioni bilanciate e stati a mosaico con una piccola proporzione di cellule aberranti.

A causa dell’alto tasso di rilevamento sul genoma completo e del fatto che non è necessaria una coltura cellulare che richiede tempo e lavoro, l’array CGH apre nuove possibilità per la diagnostica prenatale.

Ma con tutti i vantaggi e le possibilità di questa tecnica pionieristica, non bisogna dimenticare che il salto dalla ricerca alla diagnostica è appena iniziato. Così, l’array CGH non solo chiarisce le questioni aperte, l’interpretazione dei risultati può anche sollevare nuove domande:

Attraverso gli studi di array CGH, è stato scoperto che il genoma umano contiene una proporzione inaspettatamente alta di regioni il cui numero di copie varia negli esseri umani fenotipicamente normali (vedi letteratura). La dimensione di queste CNV (‘copy number variations’) varia da pochi kilobasi a diversi megabasi. Si stima che ogni individuo porti con sé almeno 3-11 di queste variazioni. I database che elencano tali polimorfismi (cioè le mutazioni che non influenzano ovviamente il fenotipo) sono appena stati creati e sono quindi ancora incompleti. Se ora si trovano aberrazioni nel DNA di un paziente tramite array CGH, è spesso speculativo se queste siano responsabili del fenotipo. Nella maggior parte dei casi, è necessario esaminare anche il DNA dei genitori.

La probabilità che un’aberrazione cromosomica sia causa di malattia aumenta

• con la dimensione dell’aberrazione
• se è presente “de novo”, i genitori non sono portatori di questa aberrazione
• se non è elencata in nessun database di polimorfismo
• se sono interessati geni che possono essere associati al fenotipo osservato
• se sono noti casi con la stessa aberrazione o un’aberrazione simile che mostrano un fenotipo simile.

Più l’array CGH sarà usato nella diagnostica clinica, più è probabile che il design dell’array si adatti alle esigenze di questo campo: Evitando le regioni CNV conosciute e favorendo le regioni cromosomiche e i geni coinvolti nel ritardo mentale e nelle sindromi dismorfiche, gli array diventeranno sempre più interessanti per la diagnostica pre e postnatale.

Il nostro istituto ha impostato il percorso per sfruttare la tecnologia degli array ora e per essere in grado di cogliere immediatamente gli sviluppi futuri. Abbiamo optato per un’attrezzatura tecnica che può anche valutare gli array con la massima risoluzione in modo affidabile e riproducibile.

Contattateci se volete utilizzare i nostri servizi e la nostra esperienza nel campo dell’array CGH. Saremo lieti di informarvi sulla durata di una tale indagine, i costi e i disegni di array che possono essere attualmente utilizzati.

Riferimenti

Array CGH nel ritardo mentale

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Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. rilevamento prenatale di riarrangiamenti cromosomici sbilanciati da array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

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Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

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