Proteine fluorescenti da A. victoria
Le proprietà spettrali di GFP o delle sue varianti risiedono nella struttura aminoacidica che forma il cromoforo (Figura 1). Questo può essere costituito dai tre aminoacidi nelle posizioni 65-67 o da residui vicini a questa posizione (per esempio YFP). Oltre alle principali mutazioni riguardanti il cromoforo, la ricerca è stata condotta anche su altre mutagenesi site-directed per migliorare altri fattori come la maturazione della proteina e l’espressione in sistemi cellulari eterologhi (ad esempio l’uso del codone, il ripiegamento della proteina a temperatura fisiologica). Si noti che A. victoria è un organismo marino relativamente primitivo senza sistema di calore corporeo.
Anche se GFP è uno dei più popolari FP a causa della sua luminosità e alta fotostabilità, ha due svantaggi principali. Questi sono una certa sensibilità al pH e una leggera tendenza a dimerizzare. La dimerizzazione o oligomerizzazione è un problema di molti FP. La loro preferenza ad agglutinarsi l’uno con l’altro può produrre artefatti o interpretazioni errate riguardanti la posizione e la funzione della proteina fusa. Ma gli scienziati hanno trovato alcune risposte anche a questo problema. Le mutazioni in posizioni critiche (F223R, L221K e A206K) dove gli aminoacidi non polari sono sostituiti da quelli idrofili mostrano una ridotta dimerizzazione. Tutti i cambiamenti genetici che portano a un miglioramento delle caratteristiche spettrali e pratiche sono riassunti sotto il nome di FP “potenziati”.
Nel caso di wtGFP, i miglioramenti portano ad un EGFP (enhanced GFP) con un singolo picco di eccitazione a 488 nm invece del precedente complesso spettro di assorbimento a 395 nm e 475 nm. La prima versione mutata di wtGFP (il mutante S65T) sviluppata da Roger Tsien et al. era cinque volte più luminosa dell’originale e mostrava un tempo di maturazione più breve. Insieme a una migliore efficienza di maturazione a 37°C, basata su un’altra mutazione (F64L), questo gioca un ruolo importante per le persone che guardano le cellule viventi.
Una variante GFP molto interessante con uno dei maggiori spostamenti di Stokes è Sapphire. Una mutazione in una posizione vicina al cromoforo (T203I) porta ad un’alterazione del massimo di eccitazione a 399 nm e del massimo di emissione a 511 nm. Questo è uno spostamento di Stokes di 112 nm. Emerald è un’altra modifica di GFP con una migliore fotostabilità e luminosità e un ripiegamento più efficiente nelle cellule dei mammiferi.
Mentre tutte le proteine fluorescenti verdi hanno una luminosità relativamente alta, le proteine fluorescenti blu normalmente soffrono di una ridotta intensità di emissione nelle applicazioni microscopiche. Ciononostante, sono usate in saggi ottici a causa di altre proprietà spettrali. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) è stata costruita da diversi cicli di mutazione di wtGFP. La prima (Y66H) ha saltato il picco di emissione dallo spettro verde a quello blu. Sono seguite altre mutazioni, producendo una proteina con un massimo di eccitazione a 380 nm e un massimo di emissione a 448 nm. Queste proprietà spettrali la rendono un partner per EGFP nella microscopia FRET. Le recenti proteine fluorescenti blu con rendimenti quantici più alti e migliore fotostabilità sono Azurite, SBFP2 e EBFP2. Un promettente successore di EBFP è una proteina chiamata Sirius che è diventata popolare per la sua altissima tolleranza al pH (stabile da pH 3-9) e la sua reputazione di essere la proteina fluorescente con la lunghezza d’onda di emissione più corta fino ad oggi.
Una seconda classe “blu” di varianti GFP è formata dalle proteine fluorescenti ciano: CFP. La sostituzione della tirosina con il triptofano (Y66W) e ulteriori alterazioni genetiche portano ad un fluorocromo con una migliore luminosità e fotostabilità. Questa ECFP ha uno spettro di eccitazione ed emissione bimodale a 433/445 nm e 475/503 nm. La luminosità è solo circa il 40% di quella dell’EGFP. Una variante ECFP importante è Cerulean, che ha un coefficiente di estinzione e una resa quantica più alti. È 1,5 volte più luminoso di ECFP ed è usato come partner FRET con YFP.
Una mutazione GFP che non altera direttamente uno dei tre aminoacidi centrali del cromoforo ha portato all’aumento delle proteine fluorescenti gialle. Le YFP hanno una treonina comune in posizione 203 che viene scambiata con una tirosina (T203Y). Questo amminoacido fa parte del β-barile e si trova in prossimità del cromoforo. Rispetto a GFP, le proprietà di eccitazione ed emissione sono state spostate a lunghezze d’onda più lunghe con massimi di eccitazione ed emissione a 514 nm e 527 nm (EYFP). Una caratteristica di EYFP è la sua sensibilità al pH. A pH 6.5 EYFP ha solo circa il 50% della sua fluorescenza, il che non è sempre uno svantaggio. Quando si tratta di misurare il pH (per esempio di vescicole, endosomi ecc.), EYFP può essere usato come indicatore. È interessante notare che un’ulteriore mutazione (Q69M) ha sviluppato una migliore stabilità acida e una luminosità drammaticamente migliorata (75% più luminosa di EGFP). Questa proteina, che ha ancora una scarsa fotostabilità rispetto a EGFP, è stata chiamata Citrine. Un altro mutante YFP (F46L) ha mostrato una velocità di maturazione drasticamente più veloce e anche una migliore resistenza al pH. Questa proteina è stata chiamata Venus ed è un accettore FRET frequente con Cerulean.