- Cosa scegliere per gli studi sul microbioma
- Che cos’è il sequenziamento del gene 16S rRNA?
- Che cos’è il sequenziamento metagenomico shotgun?
- 16S/ITS sequencing vs. sequenziamento metagenomico shotgun
- Risoluzione tassonomica
- Functional profiling
- Copertura microbica e tipo di campione consigliato
- Falsi positivi
- Interferenza del DNA ospite
- Input di DNA
- Sono qui per aiutare
- Trova quale metodo di sequenziamento è migliore per te. Parla con gli esperti che forniscono i servizi di sequenziamento ZymoBIOMICS.
Cosa scegliere per gli studi sul microbioma
Sequenziamento 16S o shotgun? Quasi tutti i ricercatori di microbioma si pongono questa domanda quando pianificano un nuovo studio, perché la stragrande maggioranza delle pubblicazioni sul microbioma utilizza il sequenziamento del gene 16S rRNA o il sequenziamento metagenomico shotgun per generare dati grezzi per il successivo profiling microbico o analisi metagenomiche. Ogni metodo ha i suoi pro e contro così, quale metodo si dovrebbe scegliere?
Che cos’è il sequenziamento del gene 16S rRNA?
Il sequenziamento del gene 16S rRNA, o semplicemente il sequenziamento 16S, utilizza la PCR per puntare e amplificare porzioni delle regioni ipervariabili (V1-V9) del gene 16S rRNA batterico1. Gli ampliconi provenienti da campioni separati sono poi dati codici a barre molecolari, raggruppati insieme e sequenziati. Dopo il sequenziamento, i dati grezzi vengono analizzati con una pipeline bioinformatica che comprende il trimming, la correzione degli errori e il confronto con un database di riferimento 16S. Dopo che le letture sono assegnate a un rango filogenetico, un profilo di tassonomia può essere generato. Analogamente, il sequenziamento ITS segue la stessa strategia, ma prendendo di mira la regione ITS (Internal transcribed spacer) che si trova nei genomi dei funghi.
Che cos’è il sequenziamento metagenomico shotgun?
A differenza del sequenziamento 16S, che prende di mira solo i geni 16S rRNA, il sequenziamento metagenomico shotgun sequenzia tutto il DNA genomico di un campione. Il flusso di lavoro di preparazione della libreria è simile al sequenziamento regolare del genoma intero, compresa la frammentazione casuale e la legatura dell’adattatore. Un flusso di lavoro tipico per l’analisi tassonomica dei dati metagenomici shotgun include il taglio di qualità e il confronto con un database di riferimento che comprende genomi interi (ad esempio Kraken2 e Centrifuge3) o geni marcatori selezionati (MetaPhlAn4 e mOTU5) per generare un profilo tassonomico. Poiché il sequenziamento metagenomico shotgun copre tutte le informazioni genetiche in un campione, i dati possono essere utilizzati per ulteriori analisi, ad esempio l’assemblaggio metagenomico e il binning, il profilo della funzione metabolica e il profilo del gene della resistenza agli antibiotici.
16S/ITS sequencing vs. sequenziamento metagenomico shotgun
Se il tuo studio richiede analisi genomiche oltre il profiling della tassonomia, come l’analisi del percorso metabolico, dovresti considerare il sequenziamento metagenomico shotgun grazie alla sua maggiore copertura genomica e all’output dei dati. Se il profiling della composizione è lo scopo principale dello studio, entrambe le tecniche hanno pro e contro da considerare (Tabella 1).
Risoluzione tassonomica
La risoluzione tassonomica del sequenziamento 16S/ITS dipende dalle regioni variabili mirate, dall’organismo stesso e dall’algoritmo di analisi della sequenza. Negli ultimi anni, alcuni metodi di correzione degli errori, ad esempio DADA26, hanno migliorato notevolmente la precisione e la risoluzione tassonomica di questa tecnica. Con DADA2, la risoluzione a livello di specie per molti organismi utilizzando il normale sequenziamento 16S è ora una realtà. Ma in teoria, il sequenziamento metagenomico shotgun può raggiungere una risoluzione a livello di ceppo perché può coprire tutte le variazioni genetiche. Anche se in pratica, l’accuratezza della risoluzione a livello di ceppo deve ancora affrontare sfide tecniche. Anche così, il sequenziamento metagenomico shotgun raggiunge una risoluzione più alta rispetto al sequenziamento 16S/ITS.
Functional profiling
Se l’analisi della funzione metabolica è un obiettivo, la maggior parte dei ricercatori trascura rapidamente il sequenziamento 16S e ITS. Ma ci sono alcuni strumenti che possono dedurre la funzione metabolica dai dati tassonomici, per esempio PICRUSt7. Ma, in generale, il sequenziamento metagenomico shotgun è spesso utilizzato quando è richiesto il profiling funzionale a causa della copertura genica aggiuntiva.
Copertura microbica e tipo di campione consigliato
Il sequenziamento shotgun esamina tutto il DNA metagenomico mentre il sequenziamento 16S esamina solo i geni 16S rRNA, che soffre anche di una copertura incompleta dei primer. Di conseguenza, il primo ha una maggiore copertura trasversale. Allora, perché la tabella 1 indica il sequenziamento 16S/ITS come migliore nella copertura dei batteri e dei funghi? Questo deriva dalla copertura delle specie dei database di riferimento disponibili, perché la previsione della tassonomia di questi approcci di sequenziamento dipende fortemente dal database di riferimento utilizzato. Attualmente, la copertura dei database 16S/ITS è molto migliore dei database del genoma intero. Questo perché i genomi interi di microbi associati al microbioma umano sono molto meglio studiati dei genomi di microbi associati ad altri ambienti. Questo è il motivo per cui si raccomanda di utilizzare il sequenziamento metagenomico shotgun per i campioni legati al microbioma umano, come le feci e la saliva, se il profiling tassonomico è lo scopo principale.
Inoltre, il sequenziamento metagenomico ha una maggiore dipendenza dal database di riferimento. Per esempio, se un batterio non ha alcun rappresentante strettamente correlato nel database di riferimento 16S, si potrebbe essere in grado di identificarlo ad un rango filogenetico superiore o come un batterio sconosciuto. Ma, nel caso del sequenziamento metagenomico shotgun, se un batterio non ha un parente stretto (un genoma dello stesso genere) nel database del genoma di riferimento, è probabile che lo manchi completamente. Per esempio, lo ZymoBIOMICS Spike-in Control I contiene due microbi estranei al microbioma umano (Imtechella halotolerans e Allobacillus halotolerans), i cui genomi non erano precedentemente disponibili. Se lo spike in un campione fecale e la sequenza con il sequenziamento shotgun, la maggior parte delle pipeline bioinformatiche li mancherà completamente a meno che non si aggiungano manualmente questi due genomi nel database di riferimento. D’altra parte, se analizzati con il sequenziamento 16S, saranno identificati grazie alla presenza della loro sequenza 16S nei database di riferimento.
Falsi positivi
Gli strumenti di correzione degli errori, come DADA2, non solo migliorano la risoluzione della tassonomia del sequenziamento 16S/ITS, ma anche la precisione. Questo è dimostrato quando si sequenzia il DNA della comunità microbica finta (ad esempio ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Tutte le sequenze 16S vengono recuperate senza errori nella sequenza, cioè senza falsi positivi. Ma, con il sequenziamento metagenomico shotgun, a meno che non ci sia un genoma perfettamente rappresentativo nel database di riferimento per un microbo sequenziato, è probabile che l’analisi bioinformatica preveda l’esistenza di più genomi “strettamente correlati”. Questi genomi strettamente correlati possono provenire da diverse specie dello stesso genere o anche da generi diversi. Per esempio, supponiamo che ci siano tre microbi strettamente correlati, A, B e C, e che condividano alcune sequenze in comune. La specie A condivide alcune sequenze solo con B e alcune altre sequenze solo con C. Se il database di riferimento contiene solo genomi di B e C, quando A è stato sequenziato, la bioinformatica predirà che sono presenti sia B che C. Per esempio, sia A che B potrebbero essere ceppi di Escherichia coli e C è Salmonella enterica; le sequenze condivise unicamente da B e C potrebbero derivare da un trasferimento genico orizzontale, che è comune tra microbi strettamente correlati. A causa di questo, il sequenziamento 16S/ITS è migliore per quanto riguarda i falsi positivi.
Interferenza del DNA ospite
La presenza di troppo DNA ospite può causare un’amplificazione aspecifica nel processo di preparazione della libreria del sequenziamento 16S e ITS, ma l’impatto è controllabile regolando i cicli di PCR e cambiando i primer. D’altra parte, l’interferenza del DNA ospite è un problema molto più difficile per il sequenziamento metagenomico shotgun anche se il costo del sequenziamento è diminuito drasticamente. A seconda del tipo di campione, alcuni campioni possono contenere >99% di DNA ospite umano, che non solo aumenta il costo della sequenza ma introduce anche incertezza nella misurazione. Questo è il motivo per cui molti ricercatori cercano la deplezione del DNA ospite, ad esempio HostZERO Microbial DNA Kit, prima della preparazione della libreria di sequenziamento shotgun. Tuttavia, potrebbe non esserci abbastanza DNA genomico microbico lasciato per il sequenziamento shotgun dopo la deplezione del DNA ospite, che in genere richiede un input minimo di 1ng. L’interferenza del DNA ospite è il motivo per cui il sequenziamento shotgun superficiale è raccomandato solo per i campioni fecali umani.
Input di DNA
Mentre il sequenziamento metagenomico Shotgun richiede un input minimo di 1 ng di DNA, il sequenziamento 16S/ITS è molto più sensibile con minimi di input di femtogrammi o anche di 10 copie di geni 16S rRNA.
Sono qui per aiutare
La scelta tra il sequenziamento 16S e il sequenziamento metagenomico shotgun è un passo critico per tutti gli studi sul microbioma. Oltre al budget, molti aspetti del progetto devono essere considerati, tra cui il tipo di campione, le analisi desiderate, la risoluzione della tassonomia e gli organismi target. Prendere in considerazione queste considerazioni ti aiuterà a scegliere il metodo di sequenziamento giusto per il tuo prossimo progetto sul microbioma. I servizi di sequenziamento del microbioma di ZymoBIOMICS offrono il sequenziamento 16S, ITS e shotgun come servizi completi dall’estrazione del DNA al sequenziamento e alla bioinformatica. Gli esperti di sequenziamento e bioinformatica di Zymo Research sono felici di aiutarti a scegliere il metodo di sequenziamento giusto per il tuo studio.
Trova quale metodo di sequenziamento è migliore per te. Parla con gli esperti che forniscono i servizi di sequenziamento ZymoBIOMICS.
Per saperne di più
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Metagenomica di prossima generazione: Sfide metodologiche e opportunità. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: classificazione ultrarapida della sequenza metagenomica usando allineamenti esatti. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuga: classificazione rapida e sensibile di sequenze metagenomiche. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic comunità microbica profiling utilizzando unico clade-specifici geni marcatori. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic specie profiling utilizzando geni marcatori filogenetici universali. Natura Metodi 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: inferenza campione ad alta risoluzione da dati di ampliconi Illumina. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive profilo funzionale di comunità microbiche utilizzando 16S rRNA marker gene sequenze. Natura Biotecnologia 2013 31(9): 814-821.
13 novembre 2019