Valutazione di una trappola a LED ultravioletta per la cattura di zanzare Anopheles e Culex nel sud-est della Tanzania

Descrizione del sistema di semi-campo e delle aree di studio per gli esperimenti di campo

Gli esperimenti sono stati condotti sia in semicampo che in campo. Tutte le prove di semi-campo sono state fatte all’interno di una grande casa schermo multicamera (28,8 × 21 m) presso l’Istituto di salute Ifakara, Ifakara, Tanzania. Abbiamo usato un compartimento che misurava 9,6 × 21 m in cui c’erano due capanne sperimentali con un’area peri-domestica costituita da diversi tipi di vegetazione e ciottoli, per imitare le abitazioni locali e l’impostazione ecologica.

I test sul campo sono stati condotti nei villaggi del distretto di Ulanga, Tanzania sud-orientale, circa 20 km a sud della città di Ifakara (Fig. 1). L’area si trova sulle pianure alluvionali di Kilombero tra le montagne Udzungwa a nord e le colline Mahenge a sud. Le principali attività economiche includono l’agricoltura (soprattutto la coltivazione del riso e del mais), la pesca e il commercio su piccola scala. Le precipitazioni annuali vanno da 1200 a 1800 mm e le temperature da 22 a 32,6 °C. Le piogge brevi si verificano da novembre a dicembre, mentre le piogge lunghe si verificano tra marzo e giugno.

Zanzare

Le zanzare utilizzate provenivano da colonie del ceppo Ifakara di Anopheles arabiensis, originariamente stabilite nel 2009 con esemplari del villaggio Lupiro, circa 25 km a sud della città di Ifakara. La colonia è mantenuta a 27 ± 2 °C e 75 ± 10% di umidità relativa (RH) come precedentemente descritto da Batista et al. Le larve sono allevate in vasche di plastica e alimentate due volte al giorno con cibo per pesci Tetramin® (Tetra GmbH, Melle, Germania). Gli adulti sono alimentati con una soluzione di glucosio al 10%. Il mantenimento della colonia ha comportato anche pasti di sangue ad libitum dati alle femmine attraverso le braccia di volontari umani. I test sul campo, invece, hanno preso di mira le zanzare selvatiche a volo libero di diverse specie dei villaggi in studio.

Trappole ed esche per zanzare

La principale trappola di prova candidata era la trappola Mosclean, che emette UV a 365 nm utilizzando la tecnologia violeds™ e genera gas CO2 attraverso una reazione fotocatalitica sulle superfici della piastra TiO2. La trappola misura 20 cm (diametro) e 28,8 cm (altezza) e funziona con corrente continua o alternata. Possono funzionare con piccole celle solari portatili per caricare un gruppo di alimentazione portatile per l’uso in luoghi senza elettricità.

Come mostrato in Fig. 2a, la trappola ha cinque componenti: (i) piastra di copertura, che ha un’etichetta di sospensione per appendere la trappola e un’ombra per ottimizzare le prestazioni dei LED UV; (ii) una ventola a bassa potenza, a basso rumore e ad alta efficienza per l’aspirazione delle zanzare; (iii) una piastra LED UV, che emette luce ultravioletta ad una lunghezza d’onda di 365 nm per attirare le zanzare; (iv) un contenitore per catturare le zanzare intrappolate; e (v) un fotocatalizzatore, che secondo il produttore rilascia gas CO2 per completare l’attrazione delle zanzare. Non abbiamo testato la produzione di CO2 da queste trappole durante i nostri esperimenti, ma abbiamo valutato le trappole così come ottenute dal produttore.

L’efficacia della trappola Mosclean è stata confrontata con quella di altre trappole esistenti comunemente usate per il campionamento di zanzare Anopheles e culicine al chiuso e all’aperto. La prima trappola è stata la CDC-light trap, ampiamente utilizzata per la cattura di zanzare da interno. La trappola CDC-light utilizza una lampadina incandescente come attrattore principale e funziona con una ventola motorizzata alimentata da una batteria. La seconda era la trappola BG-Sentinel (Biogents GmbH, Regensburg, Germania). La trappola consiste in un secchio pieghevole blu scuro, un coperchio bianco perforato, un imbuto di aspirazione, un sacchetto di raccolta e un ventilatore alimentato da una batteria. Ha un diametro di 36 cm e un’altezza di 40 cm. L’ultima trappola di confronto era la trappola Suna (Biogents GmbH), che ha un diametro di 52 cm e un’altezza di 39 cm e funziona anch’essa a batteria. La trappola Suna è stata descritta e ottimizzata per la prima volta nel Kenya occidentale nel 2014 e ha dimostrato un’elevata efficacia contro le zanzare An. funestus nell’isola di Rusinga. Recentemente è stato utilizzato in Malawi per campionare le zanzare all’interno e all’esterno.

Entrambe le trappole BG-Sentinel e Suna sono comunemente utilizzate per il campionamento delle zanzare all’aperto, e sono spesso adescate con esche BG proprietarie, gas CO2 o altre esche. In questo studio, la CO2 è stata ottenuta, quando necessario, dalla fermentazione del lievito-molassa, e utilizzata nelle diverse trappole di confronto come dettagliato di seguito. La miscela lievito-molassa è stata preparata 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti mescolando 40 g di lievito di birra e 500 ml di melassa sciolta in 2 L di acqua, e i gas effluenti incanalati tramite tubi di plastica alle trappole. Come riferimento standard, l’HLCs, eseguito da volontari maschi adulti, è stato utilizzato anche nei test semi-campo, ma non nei test sul campo in quanto le zanzare selvatiche potrebbero essere infettive.

Procedure dello studio

Test di semicampo per confrontare l’efficacia delle trappole Mosclean, CDC-light trap, human landing catches (HLC), BG-Sentinel trap e Suna trap

Gli esperimenti sono stati condotti nei compartimenti semicampo ogni notte dalle 18:00 alle 06:00. Ogni notte, 400 femmine nullipare allevate in laboratorio An. arabiensis di 3-6 giorni di età e non precedentemente alimentate con sangue sono state rilasciate all’interno della camera della screen house. Le zanzare del test sono state affamate per 6 ore prima di ogni test e sono state rilasciate all’interno delle camere 30 minuti prima di iniziare i test per acclimatarsi nell’ambiente. Le capanne sono state pulite ogni mattina (utilizzando un aspiratore Prokopack) e le trappole sono state monitorate per una funzionalità ottimale.

1. (i)

   Test per confrontare la trappola Mosclean e la trappola CDC-light utilizzando un ospite umano sotto una rete da letto come esca

In primo luogo, abbiamo confrontato la trappola Mosclean contro la trappola CDC-light per la cattura indoor in test con le due trappole nella stessa camera nelle stesse notti, in modo che le trappole fossero in competizione per le stesse zanzare. Una trappola Mosclean era sospesa all’interno di una delle capanne sperimentali, accanto a una rete da letto non trattata occupata da un volontario maschio adulto addormentato (Fig. 3b). Allo stesso modo, una trappola CDC-light era sospesa all’interno dell’altra capanna, sempre accanto a una rete da letto occupata da un volontario (Fig. 3a). Le trappole erano entrambe a 150 cm dal suolo e vicino ai piedi dei volontari. La trappola CDC-light e la trappola Mosclean sono state ruotate tra le capanne ogni notte per evitare bias di posizione. I volontari, tuttavia, hanno mantenuto le loro posizioni in modo tale che la loro attrattiva differenziale individuale è stata combinata con le rispettive caratteristiche della capanna per costituire una singola fonte di variazione sperimentale. Ogni notte, 400 zanzare An. arabiensis femmina sono state rilasciate da una posizione centrale all’interno della camera semi-campo, equidistante dalle due capanne. Il numero totale di zanzare catturate in ogni trappola durante la notte è stato registrato e le trappole sono state pulite. Il test è stato ripetuto per 12 notti, ogni trappola è stata in ogni capanna sei volte.

1. (ii)

   Test per confrontare la trappola Mosclean e le HLC usando come esca un ospite umano sotto una rete da letto

Il secondo test ha confrontato la trappola Mosclean e le HLC, anche in modo competitivo. In una capanna, una trappola Mosclean è stata posizionata accanto a una rete occupata da volontari come sopra (Fig. 3b), mentre nella seconda capanna, l’HLC è stato condotto la stessa notte da un volontario maschio adulto. I volontari si sono seduti in casa, piegando i loro pantaloni per catturare le zanzare che atterravano sulle loro gambe usando degli aspiratori a bocca. In questo modo, i due metodi di cattura erano in competizione per le stesse zanzare. La trappola Mosclean e l’HLC sono state ruotate tra le capanne ogni notte, ma i volontari sono rimasti nelle stesse capanne. Ogni notte, 400 femmine di zanzara An. arabiensis sono state rilasciate da una posizione centrale all’interno della camera semicampo, equidistante dalle capanne. Le catture di zanzare con la trappola HLC o Mosclean sono state registrate e confrontate. Il test è stato ripetuto per 12 notti, ogni metodo è stato in ogni capanna sei volte.

1. (iii)

   Test non competitivi della trappola Mosclean e delle HLC, usando come esca un ospite umano sotto una rete da letto

Nel terzo test, la trappola Mosclean è stata testata indipendentemente contro le HLC in notti separate per evitare la competizione diretta tra le trappole per le stesse zanzare. La trappola è stata posizionata all’interno della prima capanna (scelta a caso) e poi spostata nella seconda capanna la seconda notte. La terza e la quarta notte, l’HLC è stato condotto all’interno della prima o della seconda capanna in un ordine casuale. Questa sequenza è stata randomizzata in modo che i test iniziassero o con l’HLC o con la trappola Mosclean, ed è stata anche replicata sei volte. Ogni notte, 400 femmine di zanzara An. arabiensis sono state rilasciate da una posizione centrale all’interno della camera semicampo. Il numero di zanzare catturate ogni notte da ogni tipo di trappola in assenza di un’alternativa concorrente è stato registrato rispetto.

1. (iv)

   Test per confrontare direttamente la trappola Mosclean contro le trappole esterne comunemente usate, cioè Suna e BG-Sentinel

A differenza delle prime tre prove, la cattura delle zanzare in questo esperimento è stata condotta all’aperto ma all’interno delle camere semi-campo per cicli di quattro notti utilizzando un disegno randomizzato 4 × 4 Latin square. Sono state utilizzate due diverse varianti della trappola Mosclean, la prima senza alcuna esca aggiuntiva, e la seconda con l’aggiunta di CO2 dalla fermentazione del lievito-molassa. La trappola Suna (Fig. 3d) e BG-Sentinel (Fig. 3c) sono state anch’esse esche con CO2 dalla fermentazione del lievito-molassa. I quattro tipi di trappola, la trappola standard Mosclean, la trappola Mosclean con l’aggiunta di CO2, la trappola Suna con l’aggiunta di CO2 e la trappola BG-Sentinel con l’aggiunta di CO2 sono state ruotate ogni notte in modo casuale nelle quattro posizioni esterne all’interno della camera semicampo per cicli di quattro notti. Un totale di 600 femmine di An. arabiensis sono state rilasciate ogni notte in una posizione centrale equidistante da ogni posizione della trappola e le catture sono state registrate ogni mattina. L’esperimento è stato replicato sette volte nel corso di 28 notti, durante le quali ogni tipo di trappola è stato in ogni posizione sette volte.

Prove sul campo per confrontare l’efficacia delle trappole Mosclean, CDC-light trap, BG-Sentinel trap e Suna trap

Sono stati condotti quattro diversi esperimenti sul campo come segue:

1. (i)

   Confronto dell’efficacia delle trappole Mosclean e CDC-light per il campionamento delle zanzare in cerca di ospiti al chiuso

Quattro case sono state selezionate a caso in ciascuno dei villaggi in studio e reclutate dopo aver ottenuto il consenso dei capi famiglia. In ogni capanna, una trappola Mosclean o una trappola CDC-light è stata posizionata accanto a un letto all’interno di una stanza dove un volontario adulto dormiva sotto rete. Poiché la copertura delle reti trattate con insetticidi era > 90% in questi villaggi, abbiamo condotto il nostro studio con queste piuttosto che con le reti non trattate come usate nei test semi-campo. In base al programma di assegnazione delle trappole, le capanne 1, 2, 3 e 4 hanno ricevuto ciascuna uno dei due tipi di trappola. Non sono state aggiunte altre esche alle trappole. Le trappole (1a trappola Mosclean, 2a trappola Mosclean, 1a trappola CDC-light e 2a trappola CDC-light) sono state ruotate ogni notte tra ciascuna delle case per 12 notti, seguendo un disegno quadrato latino 4 × 4, replicato quattro volte. I test sono durati dalle 18:00 alle 06:00 h ogni notte. Entrambe le trappole Mosclean e CDC-light erano sospese a 150 cm dal suolo, verso i piedi delle trappole. Le zanzare catturate da ogni trappola ogni notte sono state ordinate per taxa, sesso e stato fisiologico, poi contate e registrate.

1. (ii)

   Confronto delle prestazioni della trappola Mosclean quando viene usata all’interno e all’esterno

Negli studi che misurano il rischio di punture di vettori della malaria, è comune valutare le proporzioni di punture che avvengono all’interno rispetto alle proporzioni che avvengono all’esterno, in modo da determinare dove il rischio di punture è maggiore e anche se interventi come ITNs e IRS stanno affrontando l’intero spettro di esposizione. Sfortunatamente, nonostante le recenti innovazioni come le trappole a griglia elettrica e le trappole a doppia rete con esca per l’uomo, non ci sono sistemi di cattura appropriati diversi dalle HLC che valutano in modo coerente e accurato queste proporzioni. La trappola Mosclean è stata quindi valutata per determinare se sarebbe stata adatta per le raccolte sia all’interno che all’esterno. Quattro famiglie sono state selezionate a caso in ogni villaggio e reclutate con il consenso del capofamiglia. Le trappole Mosclean sono state posizionate all’interno o all’esterno di ogni casa. Quando è stata usata all’interno, la trappola è stata posizionata accanto a una rete da letto occupata. Tuttavia, quando all’aperto, la trappola è stata posizionata a circa 5 m dalla casa, ma accanto a un volontario adulto seduto sotto una rete da letto. La trappola Mosclean all’aperto è stata posizionata a 5 m dalla casa, con l’obiettivo di catturare le zanzare che volano vicino alle abitazioni umane. Le trappole erano a 150 cm dal suolo, sia all’interno che all’esterno. Ogni mattina le zanzare catturate all’interno e all’esterno sono state classificate per taxa, sesso e stato fisiologico, e i numeri registrati e confrontati.

1. (iii)

   Test per confrontare l’efficacia sul campo delle trappole Mosclean, BG-Sentinel e Suna all’aperto

Questi esperimenti sono stati condotti all’aperto utilizzando un disegno quadrato latino 4 × 4 in cui le posizioni delle trappole sono state assegnate casualmente all’inizio di ogni turno di quattro notti di campionamento. Sono state utilizzate due varianti di trappola Mosclean, una integrata con gas CO2 dalla fermentazione del lievito-molassa e un’altra senza CO2 aggiuntiva. Sono state identificate quattro posizioni in ciascuno dei due villaggi, a circa 100 m di distanza l’una dall’altra. I quattro tipi di trappola, la trappola Mosclean standard senza esche aggiuntive, la trappola Mosclean con l’aggiunta di CO2, la trappola Suna con l’aggiunta di CO2 e la trappola BG-Sentinel con l’aggiunta di CO2, sono state ruotate ogni notte tra i quattro luoghi esterni per quattro cicli di quattro notti. Ogni mattina, le zanzare catturate da ogni trappola sono state ordinate per taxa, sesso e stato fisiologico, e i numeri registrati e confrontati. I test sono stati eseguiti nella stagione secca da giugno 2017 a febbraio 2018.

1. (iv)

   Valutazione delle proporzioni di zanzare Anopheles femmina parous e inseminate nelle catture con trappola Mosclean e CDC-light trap

Le zanzare sono state campionate in quattro diverse case di un villaggio per 20 notti. Tutte le femmine di zanzara An. arabiensis raccolte sono state sezionate. Una cattura simile è stata fatta con trappole CDC-light e le zanzare sono state sezionate sotto microscopi a luce stereo in modo che la parità e i tassi di inseminazione potessero essere confrontati.

Le ovaie o le spermateche sezionate sono state osservate con un ingrandimento 10× al microscopio composto. Lo stato di parità è stato confermato dalla presenza di tracheole ovariche allungate (femmine parous) o matasse tracheolari arrotolate (femmine nulliparous), come dettagliato. L’inseminazione è stata confermata osservando se le spermateche erano piene o non piene.

Analisi dei dati

I dati sono stati analizzati utilizzando un software statistico open source, R v.3.5.0. L’efficacia della trappola Mosclean è stata confrontata con quella delle altre trappole mediante l’adattamento di modalità miste lineari generalizzate (GLMM) utilizzando il pacchetto lme4 . Il numero di zanzare di specie diverse è stato modellato secondo distribuzioni binomiali negative, con il tipo di trappola come effetto principale. I giorni sperimentali e l’ID della capanna sono stati inclusi come termine casuale per rendere conto delle variazioni inspiegabili all’interno dei giorni e delle capanne. I grafici sono stati creati con il pacchetto ggplot2 . La regressione logistica è stata utilizzata per valutare la parità e i tassi di inseminazione tra la trappola CDC-light e la trappola Mosclean. Un test di likelihood ratio è stato utilizzato per verificare l’effetto dell’effetto casuale.