Antisense Oligonucleotides Targeted to SMN2
ASOs is single stranded nucleic acids syntized to be complementary with target RNA sequences.A. Antisense Oligonucleotideは、アンチセンスの核酸で、標的RNA配列に相補的に合成される。 ASOは、投与されると、まだ十分に定義されていないエンドサイトメカニズムによって細胞内に取り込まれ、核内に入り、標的プレmRNAに結合する62。当初、ASOは、RNA標的の翻訳をブロックするか、その分解を促進することによって、遺伝子発現を抑制するために使用されていた。 現在では、ASOは標的のプロセシングやスプライシングを変更するように設計することもできる。 SMA治療用ASOは、SMN2プレmRNAのスプライシングを変更し、エクソン7が最終的に処理された転写物に含まれるように設計されています。 先の章で述べたように、SMN2はSMN1と異なり、エクソン7の6塩基でCからTに変化する（2つの配列の間には他にも違いがあるが、機能的にはこれが最も重要である）。 エクソン7は弱い5′-スプライスサイトのために定義が弱いので、SMN2のC-to-T変異は、その組み込みから排除へとバランスを変えるのに十分である
スプライシング制御要素は、細胞のスプライシング機構によって認識される部位を決めるのに重要な役割を果たす。 SMN2に関連する要素の位置と機能は、SMN2配列を補完するように設計された一連のASOのスプライシング効果の分析によって同定された63。-66-68 ASOは、ISS-N1または他の調節要素を標的として、エクソン7の封入を確実に誘導するように設計されている。 例えば、SRリクルートメントドメイン（RSペプチド）をサイレンサーモチーフを抑制するアンチセンス配列に融合したキメラASOは、患者の線維芽細胞においてエクソン7封入とSMNタンパク質レベルを増加させることが示されている；この二重機能ASOを一回注射すると、新生児マウスの脳においてSMNタンパク質が誘導でき、寿命の延長につながった65、69。 このASO設計戦略は、ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors) として知られ、当初SMA治療薬として追求されたが、その後の研究で、SMN2エクソン7の封入に強固な効果を発揮するには、RSペプチドは必要ないことが判明した。 キメラアプローチはASOの製造に困難をもたらし、ASOの細胞透過性を制限するので、二機能性ASOはマウスで広範囲にテストされておらず、現在臨床的に開発されていない62
ISS-N1 を標的とするASOがエクソン7封入の促進に著しく効果があることが示されると、次の戦略課題はどのASOバックボーンが潜在的SMA療法に最も適しているかを明らかにすることであった。 ASOを構成するオリゴヌクレオチドは通常、細胞への取り込み、毒性、薬物動態、標的への結合などの薬物特性を最適化するために修飾される。 チバ・ガイギー社（Ciba-Geigy Ltd. ）との共同研究から生まれた、一般的な適応がある。 (2′-MOEオリゴヌクレオチドは、ヒトを含むげっ歯類と霊長類において非常に安全であることが証明されています62。 ISS-N1をブロックする2′-MOE ASOの投与は、SMAマウスの用量および時間依存的にSMN2エクソン7を増加させ、神経筋病理を改善し生存率を劇的に増加させることに成功した68、71、72 Ionis Pharmaceuticalsは、バイオジェンと共同で、ヌシネルセン（IONIS-SNRxとも呼ばれ以前はISIS-SNRxという）と呼ばれる2′-MOE ASO療法を開発中である。 非ヒト霊長類におけるヌシネルセンの前臨床試験では、1回の髄腔内注射でエクソン7包接の有意な改善に必要な組織濃度が得られ、その濃度は数カ月間維持されることが示された62。 2歳から14歳のSMA II/III型患者を対象とした第1相非盲検試験において、ヌシネルセンの単回注射は忍容性が高く、最高用量におけるHFMSEスコアの上昇と相関があるようです74。 2015年6月、イオニスは、I型乳児を対象としたヌシネルセンの進行中の非盲検第2相試験の新しいデータを発表し、乳児はこの疾患の自然史から通常予想されるよりも長く生き、より多くの運動マイルストーンを達成したことを示しました75。さらに、治療を受けた患者の剖検で得られた脳および脊髄組織における完全長SMN2 mRNAおよびSMNタンパク質の量の増加を示すデータによって本剤の作用メカニズムが支持されました。 また、Ionis社は、II/III型SMAの小児を対象とした第2相非盲検延長試験のデータを発表し、被験者の57％がHFMSEで少なくとも3ポイントの改善、6分間歩行テストで平均55mの改善を達成したことを示しました。76 ヌシネルセンの第3相試験は、現在、SMAの幼児と成人の両方を対象に実施されており（NCT02193074、NCT02292537）、結果は2017年に利用可能になる予定です。
SMA治療における2′-MOE使用に関する安全性の問題はまだ認められていませんが、他の患者集団において、いくつかの毒性が2′-MOE ASOに関連していました77、78。 これらの問題を回避できる可能性のある、SMAに使用するために研究されているもう一つのバックボーン修飾は、ホスホロアミデートモルフォリノオリゴマー（PMO）です。 ISS-N1に相補的なモルフォリノASOをICV注射すると、中枢神経系（CNS）毒性を示すことなく、SMAマウスの生存率が有意に改善された(80,81)。 エクソン7の上流にあるイントロンスプライシングサイレンサーであるISS-E1を標的としたモルフォリノも、SMAマウスの表現型を改善しました82。 さらに、SMAの治療に用いられるASOは、CNSの組織、特に運動ニューロンにおいて薬理学的活性を維持する必要があります。 バックボーンにかかわらず、SMA治療用に設計されたASOは、おそらく髄腔内注射によって脳脊髄液に直接投与される必要があります。 新生児マウスにASOを末梢投与して有効性を示した研究もあるが、若いマウスでは血液脳関門が完全に形成されておらず、末梢投与されたASOは、ヒトでは不可能な程度までCNSに浸透できる。71 心強いことに、髄腔内注入したASOは、運動ニューロン、アストロサイト、ミクログリアなどの重要なCNS組織に広く分布することが示されている72、83-85
髄腔内注入はやや侵襲的で、鎮静または麻酔を必要としますが、ASOには、高い標的特異性、顕著な効果、ASOの全身投与と比較して少ない毒性、生物製剤（ただし低分子ではない）と比較して比較的単純な製造工程など、他の実験様式と比較していくつかの重要な利点があります。 詳細は第18章
に記載されています。