ウイルスと細胞
特に指定しない限り、すべての実験はRobert Webster博士（セントジュード子供病院、アメリカ）の好意によりMDCK細胞A / メンフィス/ 14 / 96-M (H1N1) で臨床インフルエンザウイルス分離株を使って行われました 。 図5に示したウイルスは、謝辞に記載した同僚の好意により提供された。
Neu5Ac2-6Gal 末端オリゴ糖の発現を増強するために2,6-シアリル転移酵素を安定的に導入したMDCK細胞およびMDCK-SIAT1細胞については、以前に記述している. 2 mM L-グルタミン、10% ウシ胎児血清、抗生物質（ストレプトマイシン、100 mg/ml、ペニシリン、100 U/ml）を添加したDMEM（Gibco）中で両タイプの細胞を増殖させた。
オーバーレイ培地
ウイルス感染用の液体維持培地（MM）として、L-グルタミン、0.1% BSA（Sigma、A-0336）、抗生物質、1 μg/ml TPCK trypsin（Sigma, T-1426）含有EagleのMEMを使用した。
蒸留水中の1.8 % Bacto-Agar (BD, 214010) および2 % メチルセルロース (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s at 2%, Fluka) のストックは、以前に記述したように準備した.
アビセル RC/CL (FMC BioPolymer) の製造業者は試験用に3種類のアビセル (RC-581, RC-591 and CL-661) を親切に提供してくれた.アビセルは、RC-561、RC-561、CL-661の3種類がある。 2.4 gのアビセル粉末を100 mlの蒸留水に分散させ、標準的なマグネチックスターラーで1時間かけてアビセルのストックサスペンションを調製した。 寒天、MC、Avicelのストックは121℃で20分間オートクレーブ滅菌し、室温で保存した。
オーバーレイはMC、Avicelまたは溶かした寒天のストック溶液と等量の倍力維持培地を混ぜて調製した。 オーバーレイ中のMCとアビセルの濃度を変化させるため、オリジナルのストックを滅菌水で希釈した。 アビセルの濃度は2.4％であり、保存中に分離することはなかったが、希釈したアビセルは安定性に欠けた。 また，オーバーレイは使用前に必ずボルテックスまたは手で振って混合した。
6ウェルプレートでのプラークアッセイ
細胞単層にトリプシンを含まない維持培地1mlに30-50プラーク形成ユニットのウイルスを感染させてから1時間後、ウイルスを除去し、異なるオーバーレイ培地3mlで細胞を覆い、35℃、5%CO2雰囲気で培養を行った。 MCおよびAvicelオーバーレイの場合、不均一なプラークの形成を避けるために、培養期間中にプレートを乱さないように注意した。 3日間の培養後、オーバーレイを除去し、細胞を固定した。 寒天のオーバーレイは金属製のヘラを用いて除去し、MC、Avicel、液体のオーバーレイは吸引によって除去した。 細胞はMEM中の4%パラホルムアルデヒド溶液で4℃、30分間固定し、PBSで洗浄した。 その後の細胞への処理はすべて室温で行った。 0.5 % Triton-X-100と20 mM glycine in PBSを含む溶液1 ml/wellで10-20分間インキュベートすることにより、細胞を透過化すると同時に残留するアルデヒド基をブロックした。 A型インフルエンザウイルス核蛋白に特異的なモノクローナル抗体（米国疾病対策センターのAlexander Klimov博士の好意により提供）を用いて1時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（DAKO、デンマーク）で1時間、沈殿形成ペルオキシダーゼ基質で30分インキュベートし、ウイルス感染細胞を免疫染色した。 免疫試薬の作業希釈液の調製には、PBS中の10%正常馬血清と0.05%Tween-80の溶液を使用した。 一次抗体と二次抗体の後に、PBS中の0.05% Tween-80で3-5分間3回インキュベートすることで細胞を洗浄した。 ペルオキシダーゼ基質として、すぐに使えるTrue Blue™ (KPL) または0.05 M酢酸ナトリウムバッファ、pH 5.5、0.03% H2O2含有で調製したaminoethylcarbazole (AEC, Sigma) (0.4 mg/ml)の溶液を採用した。 染色したプレートは水道水で洗浄し、反応を停止させた後、乾燥させた。 水溶液中で比較的不安定なTrue Blue染色の場合、漂白を最小限にするため、プレートを逆さにして乾燥させた。 染色したプレートをフラットベッドスキャナーでスキャンし、Adobe Photoshop 7.0ソフトウェアでデータを取得した。
免疫染色の代替として、いくつかの実験ではプラークを破壊された細胞の領域として明らかにした。
96ウェルプレートでのウイルス滴定のバリエーション
1. Standard variant
96ウェルプレートのMDCKまたはMDCK-SIAT1細胞単層に、トリプシンなしの維持培地中のウイルスの連続希釈液50μl/wellを感染させた。 35℃、5％CO2で1時間インキュベートした後、ウイルスを除去し、100μl/ウェルのMCまたはAvicelオーバーレイ培地を加え、さらに24時間インキュベートしてプラーク形成を可能にした。 固定と免疫染色は、6ウェルプレートについて上述したように行ったが、ウェルあたり50μlの試薬を使用した。
2. 簡易型バリアント
アッセイは、以下の修正を加えた標準バリアントと全く同様に行った。 ウイルスとの1時間のインキュベーションの後、接種物を除去しなかった。 100μl/ウェルのAvicelオーバーレイ培地を加え、手でたたくか、プレートミキサーを使用してプレートを混合した。 培地は、ウェルに存在するウイルス含有物質によるオーバーレイの希釈を補償するために、増加した量のトリプシン（1.5μg/ml）を含んでいた。 96ウェルプレートのMDCK-SIAT1細胞の単層に、トリプシンなしの維持培地中のOCの連続10倍希釈液（濃度範囲は4nMから400μM OC）を50μl/well添加した。 次に、50μl/ウェルのウイルス希釈液（1ウェルあたり20〜40プラーク形成単位）を加えた。 プレートを混合し、35℃で1時間インキュベートして、ウイルス感染を開始させた。 その後、2μg/mlトリプシンを含む1.2%Avicelオーバーレイ培地を100μl/well加え、24時間培養し、上記のように固定し免疫染色した
6wellプレートの場合、薬剤と阻害剤のアリコートとAvicelのアリコートを1ウェルあたり0.75ml加えて感染から3日後にプラークを免疫染色した
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