子宮頸部高等級扁平上皮内病変を有する女性における円錐切除後のヒトパピローマウイルスの持続性。 A Prospective Study

Abstract

Background. ヒトパピローマウイルス（HPV）の持続感染は子宮頸癌の腫瘍形成に必要なイベントである。 我々の目的は，高グレードの扁平上皮内病変（HSIL）を有する患者における変質部大網切除術（LEEP）後のHPV感染持続率を推定し，HPV持続がタイプに関連しているかどうかを検討することである。 方法 LEEPで治療したHSIL患者89例を対象に前向き研究を実施した。 術前とLEEP後6、12、18ヶ月目にDNA HPVを実施した。 結果は以下の通り。 4名の患者が研究対象から除外された。 残りの85人の患者のHPV残存率は32.95%（6ヶ月）、14.12%（12ヶ月）、10.59%（18ヶ月）であった。 16型が最も残存率が高く，23.5％（6カ月），11.8％（12カ月），8.2％（18カ月）であった。 共感染は，LEEP前が54.12％，LEEP後が18.8％（6カ月），4.7％（12カ月），3.5％（18カ月）であった。 16型を含む重複感染の割合は46.83％であった。 16型を含む重複感染は，16型のみの感染と比較して，高い持続率との相関は認められなかった． 結論 PAP塗抹標本でHSIL病変を有する患者では，LEEPによってHPV感染が完全に根絶されることはない。 LEEP後のHPVの残存率はHPVの型に影響される。 HPV16型は最も高い残存率を示した。 はじめに

ヒトパピローマウイルス（HPV）の持続感染は子宮頸癌の腫瘍形成に必要な事象である。 子宮頸癌のほぼすべての腫瘍細胞はHPVの配列を含んでいる。 HPVは、世界で最も頻度の高い性感染症である。 感染の大部分は一過性で、最初の1年間で70％、2年間で90％が退縮する。10〜20％の感染は持続し、前腫瘍性病変から癌への進展を可能にする。 200種類あるHPVの遺伝子型のうち、肛門性器粘膜を好むのは40種類だけで、そのうち18種類が子宮頸がんに直接関連している。 HPVのうち、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82の15種類が、強い発癌性を持つ高リスク型ヒト乳頭腫ウイルス（HR-HPV）と定義されている。 これらのHR-HPV型は、子宮頸がん全体の95％を占めています。 複数のHPV型に同時に感染することはよくあることです。

HPV 16および18は世界で最もよく見られるHR-HPV型で、全扁平上皮癌（SCC）の約70％、全腺癌の最大85％を占めます。 HPV 16は最も発癌性の高いHPV遺伝子型で、HPV 18は扁平上皮癌と比較して腺癌の割合が大きい。 HPV 16と18の後、さらに20％を占める最も一般的な6つの型は、31、33、35、45、52、58型である 。

LEEP（large loop excision of the transformation zone）などの子宮頸部切除は、診断だけでなく、子宮頸上皮内新生物（CIN）に対して適切な治療法である 。 しかし、CINは再発することがあり、そのようなCINの治療後に浸潤性子宮頸癌を発症することがあります。 本研究の目的は、高悪性度上皮内扁平上皮病変（HSIL）患者におけるLEEP後のHPV感染持続率を推定し、HPV持続がタイプに関連しているかどうかを調べることである。 材料と方法

患者の選択。 前向き研究を行った。 2010年1月から2014年5月の間にTimişoaraにあるUniversity of Medicine and Pharmacy “Victor Babeş” Obstetrics and GynecologyにLEEPのために紹介されたPAPスミアでHSIL細胞診を行った全患者を本研究の対象とした。 従来の細胞診は、Bethesda 2001の基準に従って実施され、評価された。 全例にコルポスコピーによる評価を行い、国際子宮頸部病理学・コルポスコピー連盟（IFCPC）の基準を使用した。 全例にルゴール液塗布後，コルポスコピー視認下でLEEPを施行した． 手術中、コルポスコピー的に異常な所見はすべて切除され、組織の深さは少なくとも6mmを目指した。 すべての手術は同じチームの外科医によって行われた。 全例でLEEPの前にDNA HPV検査を実施した。 DNA HPV検査はLEEP後6カ月、12カ月、18カ月に繰り返された。 LEEP前にDNA HPVが陰性であった患者は研究から除外された。 すべての検体は，アンプリコンのリバースハイブリダイゼーションに基づくLINEAR ARRAY HPV Genotyping Test（CE-IVD社）を用いて検査された． 子宮頸部検体から37種類のHPV（6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，45，51，52，53，54，55，56，58，59，61，62，64，67，68，69，70，72，73，81，82，83，84，IS39，CP6108）のDNAをウイルスゲノム中の保存L1領域が標的となる多重PCRにより検出した。 遺伝子型判定にはGene Amp PCR System 9700を使用し、メーカーの説明書に従って判定を行った。 HPV DNAの自動ハイブリダイゼーションと検出はProfiBlot 48 (Tecan Trading AG, Zurich, Switzerland)で行った。 LEEP後の切除断端が陽性であった患者は研究から除外した。

研究への参加に先立って、すべての患者からインフォームドコンセントを得た。 すべての手順は1964年のヘルシンキ宣言とその後の修正で定められた倫理基準に従って行われ，ティミショアラのUniversity of Medicine and Pharmacy “Victor Babeş “の施設審査委員会と倫理委員会によって承認された。

統計分析はSPSS v17とEpi Info 7を用いて行われた。 数値の計算にはノンパラメトリック検定（Wilcoxon sign rankとchi square）を用いた。 結果

PAPスミア検査でHSILと診断された患者計89名が当院に紹介された。 初回のDNA HPV検査後，2名の患者が陰性と判定され，研究から除外された。 これらの患者を除外したのは，LEEP後のHPVの残存を調査したかったからである。

別の2人の患者はLEEP標本で断端が陽性であり、これも試験から除外された。 残りの85人の患者は、LEEP後6カ月、12カ月、18カ月にDNA HPVの検査を受けた。 残りの患者はすべてLEEP前にHR-HPVが陽性であった。 LEEP前に検出されたHPVの型は、16型50.6％、18型24.7％、31型20％、33型24.7％、35型11.8％、45型7.1％、52型27.1％、58型9.4％、6型9.4％、11型5.9％、その他の型5.9％である。 LEEP後6カ月時点での全体の持続率は32.95％（28人），12カ月時点で14.12％（12人），18カ月時点で10.59％（9人）であった。 HPV型ごとの6ヵ月，12ヵ月，18ヵ月における当グループの残存率を表1に示す． 12カ月および18カ月時点のウイルス残存率は，6カ月時点で陽性であった患者のみに認められた。 16型は最も残存率が高く，6カ月で23.5％，12カ月で10.6％，18カ月で8.2％であることが分かった。 16型は他の高リスク型と比較して、有意に持続リスクが高いことがわかった（表2）。

複数のHPV型の存在と定義されるCoinfectionは、LEEP前54.12％、6ヶ月後18.8％、12ヶ月後4.7％、18ヶ月後3.5％であることがわかった（表1）。 16型を含む重複感染症は全体の46.83％を占めた。 16型陽性患者は，他の型への感染や重複感染を示す患者よりも有意に高い感染持続リスクを有していた（表3，4）． また，16型との重複感染は，16型のみの感染と比較して高い持続率とは相関が認められなかった（表5）．

4.考察

子宮頸がんは、依然として世界中の女性の罹患率と死亡率の主要な原因である。 子宮頸がんは、高リスク型ヒト乳頭腫ウイルス（HR-HPV）感染の獲得と持続、およびそれに続く子宮頸部上皮細胞の悪性転換によって引き起こされる。 HPVの持続感染は、CIN発症の主要な要因である。 HPV感染から子宮頸部病変またはクリアランスへの進行の自然史をJaisamrarnら（2013）が調査しています。 彼らは、全HPV感染の53％、79％、87％、89％がそれぞれ12、24、36、48カ月でクリアとなり、HPV16とHPV31は非発癌性HPVよりもクリアになる確率が有意に低いことを明らかにした 。 高リスクHPV感染の持続は子宮頸がん発症の重要な要因であり、ウイルスの持続の検出は子宮頸がんのリスクが最も高い女性を特定するために用いることができる。

子宮頸部のコーン切除は、HR-HPV感染とCINを有効に根絶できる診断と治療の両方の手順と考えられている。 コーン切除により病変部全体を切除し，切除断端が陰性であるにもかかわらず，HPV感染が残存する症例がある。 LEEP後のHPV感染のクリアランス／残存を調査した研究では，年齢，病変のグレード，マージンの状態がHPV残存の危険因子であることが報告されている。 我々の6カ月後の残存率は32.95％であった。 同じ方法を用いた他の著者らは，6カ月時点のHPV残存率が14.3％から21.5％と低いと報告している。 我々は、HSILの患者のみを選択したことと、本研究のすべての患者がHR-HPVに感染していたことが、より高い持続率の原因であると考えている。 ParkらやNamらも高グレード病変がLEEP後のHPV残存のリスクファクターであることを明らかにしている

我々は切除後の断端が陰性の患者におけるHPV感染の残存を調査したかったので、切除後の断端が陽性の患者は調査から除外した。 切除断端陽性の存在は，HPVの残存や疾患の再発・進行の大きな要因と考えられている。 Alonsoら（2006）は、コーンマージン陽性が再発の高リスクと有意に関連することを見出した 。 HSILを有する患者を選択したのは，高リスク型HPVに感染している可能性が高く，HSIL病変は浸潤性疾患に進行しやすいからである。 我々は，LEEP後のHPV感染の持続を調べることが目的であったため，LEEP前のHPV DNAが陰性の患者は除外した。

Several authors investigation and finding that viral load prior to LEEP is a risk factor for HPV persistence . 高ウイルス量（RLU/PC ≥ 100）は、HPV 持続性と疾患再発の危険因子と考えられていた。 HPVウイルス負荷の測定は広く普及していないため、LEEP後のHPV残存リスクが特定のHPVの型に関連しているかどうかを調査しました。 これは、リスク層別化およびより慎重に評価すべき患者群の選択に有用であると考える。 DNA HPVはHPVウイルス量評価よりも広く使用されている検査であるため、型に関連する持続性に着目した。

LEEPの前後で同じHPV型が確認された場合を持続性とみなした。 どの患者においてもLEEP後に新しい型のHPVは発見されなかった。 12カ月および18カ月におけるウイルスの残存は、LEEP後6カ月で陽性となった患者でのみ認められた。 8022>

我々の研究では、HPV16型はLEEP後のHPV持続に有利な因子であることが判明した。 我々の結果は，同様のグループ（77人）で円錐切除後のHPV持続に関連する因子を調査し，年齢，細胞診，パンチ生検組織診，HPVウイルス量，円錐切除組織診のうち，術前のHPV16型感染がHPV持続の唯一の有意な独立因子（）であるとしたNamら（2009）の結果と一致するものである

また我々の結果は，術後12カ月でほとんどのHPV感染が消失し，この期間以降ではごくわずかであるとする。 我々は、LEEP後のHPV DNAフォローアップエンドポイントを12カ月とすることを提案する。 また，12カ月後に感染が持続している患者は，感染が消失するよりも病勢が進行する可能性が高いと考えるが，この記述を証明するためには，より多くのデータが必要である。 HPV DNAの残存またはクリアランスは、子宮頸部異形成の治療後の失敗または治癒の早期有効な予後マーカーと考えられており、LEEP時の細胞診や切片縁の状態よりも正確である」

LEEP後の12カ月におけるHPV DNAは、病気の進行を経験しそうな患者を識別するために、有用なツールになると示唆された。 Kockenらのメタアナリシス（2012年）によると、HPV検査は細胞診よりも高グレードの治療後病変を検出する感度が高く、特異度もほぼ同じであるため、治療後6カ月以降の検査に含めるべきとされています 。 LEEP後の子宮頸部異形成の再発は、HPVの残存とも関係がある。 複数の研究者が、治療後の残存／再発病変をより正確に検出するために、追跡細胞診と比較したHPV DNA検査の感度と特異度を解析している . HPV検査は経過観察細胞診よりも感度が高く、特異度は同程度であることが判明した。 術後にHPVが陽性である女性は治療失敗のリスクが高い。 これはBrismarらも報告している。これらはハイリスク型とは考えられていないが、コンジローマと関連している。 これは年齢、性行動、免疫反応、HPV検出方法などの要因によるものである。 Liawらは1124人の患者を対象にした研究で，HPV 16型は他の型より長く持続するが，その後併発した他のHPV感染症の持続に変化はないことを明らかにした． このことは、16型が最も持続率が高いという我々の結果と一致している（表2）。 また，16型への感染は，16型を含まない同時感染よりも持続率が高いことも明らかになった（表3）． また，16型を含む同時感染は，16型単独の感染と比較して，持続率の高さとは相関がなかった（表5）． このことは，16型の存在が感染持続の最も重要な要因であることを示している。

この研究の強みは，研究の前向きな性質とHSILの患者のみを選択したことにある。 このようにして、HR-HPVに感染している可能性が高く、LEEP後の再発や癌への病勢進行にさらされる、まさにそのような患者カテゴリーを調査したのである

5. 結論

PAP塗抹標本でHSIL病変を有する患者において，HPV感染はLEEPによって完全に根絶されない。 LEEP後のHPVの残存はHPVの型に影響される。 HPV 16型が最も残存率が高い。

今回の結果は、特にHPV 16型がLEEP前に確認された場合、HSILに対してLEEPを受けた患者のフォローアップにHPV DNA検査を導入することを強く提唱する。

追記

登録名は Laurențiu Pirtea

競合利益

著者は競合利益を申告しないことを明言した。

謝辞

この論文は、グラントPII-C2-TC-2014-06、University of Medicine and Pharmacy “Victor Babeş”, Timişoara, Romaniaによって支援されました。

補足資料