固定の重要性
組織を顕微鏡で研究するには、組織を保存し（固定）、半透明になるほど薄く切片にする必要があります。 固定は、組織切片の作製において非常に重要なステップです。 最適な条件で行わなかったり、固定が遅れたりすると、組織標本が不可逆的に損傷することがあります。
組織固定の大きな目的は、細胞や組織成分を「生命に近い状態」で保存し、生きた組織への変化をできるだけ少なくし、薄く染色された切片の作成を可能にするような方法でこれを行うことである。 固定剤と固定プロトコルの選択は、予定されている追加の処理工程や最終的な分析によって異なる場合があります。 完璧な固定剤はありませんが、ホルムアルデヒドが最も近いと言えます。
固定方法の種類
組織の固定は、化学的または物理的手段によって達成することができる。
化学的固定は通常、固定剤に試料を浸す（浸漬固定）か、小動物や肺などの一部の全臓器の場合は血管系を固定剤で灌流する（灌流固定）ことによって行われます。 特殊な組織化学的処置では、固定剤を蒸気の形で適用することもある。
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固定のメカニズム
化学的固定の主なメカニズムは、架橋と凝固の2つである。
架橋は、タンパク質内とタンパク質間の共有結合の形成を伴い、組織を硬くして分解を防ぐ。
凝固は、アルコールまたはアセトンの使用によるタンパク質の脱水によって起こる。 これらの試薬は、細胞や組織中の自由水を除去して入れ替え、疎水性結合を不安定にすることによって、タンパク質の三次構造に変化を起こす。 これは変性とも呼ばれる。
固定に影響する因子
- 温度。 一般に、温度の上昇は固定化率を高めるが、自己分解や細胞成分の拡散率も上昇させる。 従来、0〜4℃が理想的な温度あるいは標本の固定と考えられてきた。 現在では室温での固定が日常的に行われている。
- サイズ：1～4mm厚
- 体積比。 組織体積の15～20倍以上
- 時間：24～48時間
- pH: pH4～9の生理的範囲に保つ必要がある。 超微細構造保存のためのpHは7.2〜7.4の間で緩衝化することが望ましい。
プロトコル
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役立つリンク
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