- Which to Choose For Microbiome Studies
- What is 16S rRNA Gene Sequencing?
- Shotgun Metagenomic Sequencing とは？ ライブラリー調製のワークフローは、ランダムフラグメンテーションやアダプターライゲーションなど、通常の全ゲノムシーケンスと同様です。 ショットガンメタゲノムデータの分類解析の典型的なワークフローは、品質トリミングと、全ゲノム（例：Kraken2、Centrifuge3）または選択したマーカー遺伝子（MetaPhlAn4、mOTU5）からなる参照データベースとの比較により分類プロファイルを生成することです。 ショットガンメタゲノムシーケンスはサンプルの全遺伝情報を網羅するため、そのデータはメタゲノム解析やビニング、代謝機能プロファイリング、抗生物質耐性遺伝子プロファイリングなどの追加解析に用いることができる。 shotgun metagenomic sequencing
- Taxonomy resolution
- 機能プロファイリング
- Microbial coverage and recommended sample type
- 偽陽性
- Host DNA interference
- DNA input
- Here to Help
- どのシーケンス法が最適かをご確認ください。 ZymoBIOMICS Sequencing Servicesを提供する専門家にご相談ください。
Which to Choose For Microbiome Studies
16Sシーケンスとショットガンシーケンスの比較は？ マイクロバイオームに関する出版物の大半は、その後の微生物プロファイリングやメタゲノム解析のための生データを生成するために、16S rRNA遺伝子シーケンスまたはショットガン・メタゲノムシーケンスのいずれかを利用しているため、新しい研究を計画する際には、ほぼすべてのマイクロバイオーム研究者がこの質問を自問自答します。 各手法には長所と短所があるため、どの方法を選ぶべきでしょうか。
What is 16S rRNA Gene Sequencing?
16S rRNA遺伝子シーケンス、または単に16Sシーケンスでは、細菌の16S rRNA遺伝子の超可変領域（V1～V9）の一部をターゲットとし増幅するPCRを使用します1。 別々のサンプルのアンプリコンに分子バーコードを付与してプールし、塩基配列を決定します。 配列決定後、トリミング、エラー修正、16S参照データベースとの比較を含むバイオインフォマティクス・パイプラインで生データを解析する。 リードを系統学的ランクに割り当てた後、分類学的プロファイルを作成することができる。 同様に、ITS シークエンスも同じ戦略ですが、真菌ゲノムに見られる ITS (Internal transcribed spacer) 領域をターゲットとしています。
Shotgun Metagenomic Sequencing とは？ ライブラリー調製のワークフローは、ランダムフラグメンテーションやアダプターライゲーションなど、通常の全ゲノムシーケンスと同様です。 ショットガンメタゲノムデータの分類解析の典型的なワークフローは、品質トリミングと、全ゲノム（例：Kraken2、Centrifuge3）または選択したマーカー遺伝子（MetaPhlAn4、mOTU5）からなる参照データベースとの比較により分類プロファイルを生成することです。 ショットガンメタゲノムシーケンスはサンプルの全遺伝情報を網羅するため、そのデータはメタゲノム解析やビニング、代謝機能プロファイリング、抗生物質耐性遺伝子プロファイリングなどの追加解析に用いることができる。 shotgun metagenomic sequencing
代謝パスウェイ解析など、分類プロファイリング以外のゲノム解析が必要な場合は、ゲノムカバレッジとデータ出力が大きいショットガン・メタゲノムシーケンスを検討する必要があります。 組成プロファイリングが研究の主な目的である場合、どちらの手法にも考慮すべき長所と短所があります（表1）。
限定的
属->類->類 属->類->類->類->類->類類->類
機能性プロファイル
Taxonomy resolution
16S/ITSシーケンスの分類分解能は、対象とする可変領域、生物自体、および配列解析アルゴリズムに依存します。 近年、DADA26などのエラー訂正手法により、この手法の精度と分類学的解像度は飛躍的に向上した。 DADA2により、通常の16Sシーケンスを用いた多くの生物の種レベルの分類解像度が現実のものとなってきた。 しかし、理論的には、ショットガンメタゲノムシーケンスはすべての遺伝的変異をカバーできるため、株レベルの分解能を達成することができます。 しかし、実際には、株レベルの解像度の精度はまだ技術的な課題を抱えています。 8352>
機能プロファイリング
代謝機能解析が目的である場合、ほとんどの研究者は16SおよびITSシーケンスをすぐに見過ごしてしまうでしょう。 しかし、PICRUSt7など、分類データから代謝機能を推測するツールもある。 8352>
Microbial coverage and recommended sample type
ショットガンシーケンスはすべてのメタゲノムDNAを調べるのに対し、16Sシーケンスは16S rRNA遺伝子のみを調べ、プライマーカバレッジが不完全であることも問題になっている。 その結果、前者の方が領域横断的なカバー率が高い。 では、なぜ表1では16S/ITSシーケンスの方が細菌と真菌のカバー率が高いのだろうか？ これは、これらのシーケンシングアプローチの分類予測は、使用する参照データベースに大きく依存するため、利用可能な参照データベースの種カバレッジに起因している。 現在、16S/ITSデータベースのカバレッジは全ゲノムデータベースよりはるかに優れています。 これは、ヒトのマイクロバイオームに関連する微生物の全ゲノムが、他の環境に関連する微生物のゲノムよりもはるかによく研究されているためである。 8352>
さらに、メタゲノムシーケンスは参照データベースへの依存度が高く、糞便や唾液などのヒト微生物に関連するサンプルについては、ショットガンメタゲノムシーケンスを使用することが推奨されるのはこのためです。 例えば、ある細菌が16S参照データベースに近縁の代表的なものがない場合、より高い系統学的ランクで、あるいは未知の細菌として同定できるかもしれない。 しかし、ショットガンメタゲノムシーケンスの場合、参照ゲノムデータベースに近縁種（同属のゲノム）がない細菌は、完全に見逃してしまう可能性が高いのです。 例えば、ZymoBIOMICS Spike-in Control Iには、これまでゲノムを入手できなかったヒトマイクロバイオームにとって外来種の2つの微生物（Imtechella halotoleransとAllobacillus halotolerans）が含まれています。 糞便サンプルにスパイクしてショットガンシーケンスで配列決定した場合、この2つのゲノムを参照データベースに手動で追加しない限り、ほとんどのバイオインフォマティクスパイプラインはこれらを完全に見逃してしまいます。 一方、16S シーケンスで解析した場合、参照データベースにその 16S 配列が存在するため、同定されます。
偽陽性
DADA2のようなエラー修正ツールは、16S/ITSシーケンスの分類分解能を高めるだけでなく、精度も向上させます。 これは、模擬微生物群集（ZymoBIOMICS Microbial Community Standardなど）のDNAをシーケンスした際に実証されました。 すべての16S配列は、配列に誤りがない、すなわち偽陽性がない状態で回収されます。 しかし、ショットガンメタゲノムシーケンスでは、配列決定された微生物の参照データベースに完全な代表ゲノムが存在しない限り、バイオインフォマティクス解析により複数の「近縁」ゲノムの存在が予測される可能性がある。 これらの近縁種ゲノムは、同じ属の異なる種のものであってもよいし、異なる属のものであってもよい。 例えば、A,B,Cという3つの近縁の微生物があり、いくつかの配列を共通して持っているとする。 Aという種はBとだけ、Cとだけある配列を共有している。もし参照データベースにBとCのゲノムしか含まれていなければ、Aが配列決定されたとき、バイオインフォマティクスはBとCの両方が存在すると予測する。 例えば、AとBはどちらも大腸菌で、Cはサルモネラ菌である可能性がある。BとCが独自に共有する配列は、近縁の微生物間でよく見られる水平方向の遺伝子移動に由来する可能性がある。 このため、16S/ITSシーケンシングは偽陽性に関して優れている。
Host DNA interference
16SおよびITSシーケンシングのライブラリー作成過程で、宿主DNAが過剰に存在すると非特異的増幅を引き起こすが、PCRサイクルを調整し、プライマーを変更すれば影響は制御可能である。 一方、ショットガンメタゲノムシーケンスでは、シーケンサーのコストが劇的に低下したとはいえ、宿主DNAの干渉はより困難な問題である。 サンプルの種類によっては、>99%ヒト宿主DNAを含むサンプルもあり、シーケンスコストが高くなるだけでなく、測定に不確実性が生じます。 このため、多くの研究者はショットガンシーケンスのライブラリ調製の前に、HostZERO Microbial DNA KitなどのホストDNAの枯渇を検討しています。 しかし、ホストDNAの枯渇後、ショットガンシーケンスに十分な微生物ゲノムDNAが残らない場合があり、通常、最低1ngのインプットが必要です。 8352>
DNA input
ショットガンメタゲノムシーケンスは最小で1 ngのDNAインプットを必要としますが、16S/ITSシーケンスはより感度が高く、最小インプットは16S rRNA遺伝子の10コピーとさえ言われています。
Here to Help
16Sシーケンスとショットガン・メタゲノムシーケンスの選択は、すべてのマイクロバイオーム研究にとって重要なステップとなります。 予算に加えて、サンプルタイプ、希望する解析、分類の分解能、対象生物など、プロジェクトの多くの側面を考慮する必要があります。 これらの点を考慮することで、次のマイクロバイオームプロジェクトに適したシーケンス手法を選択することができます。 ZymoBIOMICSのマイクロバイオームシーケンスサービスは、16S、ITS、ショットガンシーケンスを、DNA抽出からシーケンス、バイオインフォマティクスまで一貫したサービスとして提供しています。 Zymo Researchのシーケンスおよびバイオインフォマティクスの専門家が、お客様の研究に適したシーケンス法の選択をお手伝いします。
どのシーケンス法が最適かをご確認ください。 ZymoBIOMICS Sequencing Servicesを提供する専門家にご相談ください。
詳細はこちら
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: 方法論的な課題と可能性。 オミックス・ア・ジャーナル・オブ・インテグレイティブ・バイオロジー2019 23(7): 327-333.
2.ウッドDE、サルツバーグSL. Kraken: 正確なアラインメントを用いた超高速メタゲノム配列分類。 ゲノムバイオロジー 2014 15(3): R46.
3.キムD、ソングL、ブライトウィーザーFP、サルツバーグSL. Centrifuge: Rapid and Sensitive Classification of Metagenomic sequences（遠心分離機：メタゲノム配列の迅速かつ高感度な分類）。 ゲノムリサーチ2016 26(12): 1721-1729.
4.セガタN、ウォルドロンL、バラリーニA、ナラシンハンV、ジュウソンO、ハッテンハワーC.ユニークなクレード特異的マーカー遺伝子を用いたメタゲノム微生物コミュニティプロファイリング。 Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. 砂川聡、他、普遍的な系統樹マーカー遺伝子を用いたメタゲノム生物種プロファイリング. ネイチャー・メソッズ 2013 10(12): 1196-1199.
6.キャラハンBJ、マクマーディPJ、ローゼンMJ、ハンAW、ジョンソンAJA、ホームズSP. DADA2：イルミナのアンプリコンデータからの高解像度サンプル推論。 ネイチャー・メソッズ 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. 16S rRNAマーカー遺伝子配列による微生物コミュニティの予測機能プロファイル.Predictive Functional Profiling of microbial Communities using 16S RTM, Huttenhower C. ネイチャー・バイオテクノロジー 2013 31(9): 814-821.
2019年11月13日号