Braz J Med Biol Res, October 2003, Volume 36(10) 1447-1454
5αリダクターゼ1型遺伝子は、多毛女性と健常者の頭頂部から摘出した無毛髪に発現しているが、2型は発現していない
I.O. Oliveira1,2、C. Lhullier1、I.S. Brum1、P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, ブラジル
要旨
Abstract
本研究の目的は、1型（SDR5A1）および2型（SDR5A2）の5a-の遺伝子の発現を明らかにすることであった。多毛症患者33名（多嚢胞性卵巣症候群20名、特発性多毛症13名）の頭髪を採取し、男性10名、健常女性15名の頭髪と比較して、還元酵素アイソザイムを調べた。 SDR5A1とSDR5A2の発現は、ユビキタス発現タンパク質であるβ2-ミクログロブリンの遺伝子を内部対照として、RT-PCRにより推定した。 結果は、β2-ミクログロブリンの吸光度に対する任意の単位で表した（平均±SEM）。 SDR5A2の発現は、本研究で分析したどの毛髪サンプルでも検出されなかった。 SDR5A1 mRNAレベルには、男性と正常な女性との間に差異は認められなかった（それぞれ0.78 ± 0.05 vs 0.74 ± 0.06）。 また、健常女性の頭皮から抜いた毛髪の細胞におけるSDR5A1遺伝子の発現（0.85±0.04）、多嚢胞性卵巣症候群（0.78±0.05）および特発性多毛症（0.80±0.06）の女性も同様であった。 これらの結果から、頭皮の頂部領域の毛包ケラチノサイトにおけるSDR5A1遺伝子の発現は、健常男女と多毛症患者で観察される発毛の違いとは関係がないようであることが示された。 毛髪の成長過程や関連疾患に対するアンドロゲン作用のメカニズムを解明するために、毛乳頭などの他の頭皮毛包区画や他の部位の毛包における5a-還元酵素遺伝子の発現を調査するために、さらなる研究が必要である
Key words: 毛包、多毛症、5a-還元酵素、多嚢胞性卵巣症候群
はじめに
アンドロゲンは人間の発毛を主に調節しており、主な臨床発毛障害の一つである多毛症と関連している。 この状態は、体毛分布の男性パターンを持つ女性の過度の体毛成長に相当する。 多毛症の存在は、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、アンドロゲン分泌腫瘍、および非古典的副腎過形成などの卵巣および/または副腎によるアンドロゲン分泌の増加に関連する状態を示すことがあり、または循環アンドロゲンに対する末梢過敏性（特発性多毛症、IH）に起因することがあります（1-3）。 一般に、この症状は生命を脅かすものではありませんが、患者さんにとって大きな苦痛であり、心理社会的に大きな悪影響を及ぼします。 多毛症の存在下での毛髪成長に対するアンドロゲンの効果を調査することは、ヒトの毛包生物学に関する知識を向上させるはずです。
すべての活性アンドロゲンの標的細胞への効果は、同じ核アンドロゲン受容体への結合により媒介されます。 アンドロゲン抵抗性症候群に関するこれまでの研究により、アンドロゲン依存性毛髪成長に対するアンドロゲン受容体の重要性が明らかになりました（4-6）。 より最近では、禿げた男性の頭皮毛髪細胞において、アンドロゲン結合能の増加が観察されました（7）。 3072>
毛包は、アンドロゲン代謝を自律的にコントロールし、局所の要求に応じて、ステロイドホルモンの生産と分解を調節しています（10）。 正常な状態では、5a-リダクターゼは、毛包に対するアンドロゲンの作用において重要な役割を担っており、テストステロンをより強力なアンドロゲンであるジヒドロテストステロンに変換しています（11,12）。 分子クローニングの研究により、タイプ1およびタイプ2の5a-リダクターゼのアイソザイムをコードする2つの遺伝子が特徴付けられている(13,14)。 皮膚で優勢な5a-還元酵素アイソザイムは1型（SDR5A1）（15）で、前立腺に特徴的な5a-還元酵素2型（SDR5A2）と60％の相同性を持つ（14）。 多毛症患者の生殖器および陰部の皮膚線維芽細胞において、正常女性の皮膚と比較して5a-リダクターゼ活性の増加が証明された(8,16)。 これらの研究は、血漿中のアンドロゲンレベルが上昇しないことを特徴とするIHにおいても、5a-リダクターゼ活性の増加を報告している(17)。 さらに、多毛患者の陰部皮膚には、健常者の陰部皮膚と同じSDR5A1アイソフォームが発現しているが、SDR5A2は健常者と多毛患者の両方の性器皮膚に主に発現している(18)。 しかし、5a-還元酵素の生理学的役割は完全には解明されておらず、異なる皮膚コンパートメントにおけるその分布もまだ不明である。 いくつかの免疫組織化学的、酵素活性研究によると、SDR5A1酵素は皮脂腺、汗腺、表皮細胞、毛包の根鞘細胞、毛乳頭細胞に多く発現し(19-21)、一方SDR5A2はこれらの部位では非常に低いレベルでしか発現しないことが示唆されている。 一方、他の研究では、毛包内のこれらのアイソザイムの分布が異なることが示されている (22-24)。 SDR5A1はSDR5A2と比較して、毛包区画に多く分布しているようである。 さらに、毛根鞘ケラチノサイトはSDR5A1遺伝子の高発現を示すことから、毛包のアンドロゲン代謝に重要な役割を担っていると考えられる。
患者と方法
被験者
研究対象者は、ブラジル、ポルト・アレグレのクリニカ病院婦人科内分泌科で6ヶ月間に連続して診察された多毛症の女性であった。 12歳から42歳までの33名の患者が本研究の対象として選択された。 20名の患者がPCOS、13名の患者がIHと診断された。 PCOSの診断は、高アンドロゲン血症、月経周期の乱れ、血清黄体形成ホルモン（LH）値またはLH/卵胞刺激ホルモン比の上昇、総テストステロン値および/または遊離アンドロゲン指数（FAI）の上昇、超音波による両側肥大多嚢胞性卵巣（25、26）、卵巣・副腎新生物およびクッシング症候群が認められないという身体所見に基づいて行われた。 IHは、規則的な排卵周期（黄体期のプロゲステロン値が3.8ng/ml以上）を持ち、アンドロゲン値が正常で、既知の基礎疾患のない毛深い患者において、以前記載したように診断された（27）。
遅発性（非クラシック）先天性副腎過形成の患者は、17-ヒドロキシプロゲステロンの高い血漿レベル（>5 ng/ml）および／またはACTH刺激後の著しい増加（>12 ng/ml）に基づいて、この研究の対象とはならなかった（28, 29）。 また、高プロラクチン血症（異なる2つの機会で血清プロラクチン値が20μg/lより高い）の患者も除外した。
16-37歳の月経周期が正常な女性15名と16-29歳の男性10名もこの研究に選ばれ、ポルト・アレグレ臨床病院倫理委員会によって承認された。 各被験者からインフォームドコンセントを得た。 3072>
SDR5A1 と SDR5A2 の mRNA レベルは、正常男性、正常女性、多毛患者の頭頂部から摘出した毛髪細胞において、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって推定された。
試験プロトコル
人体計測では、体重、身長、肥満度（BMI = 現在の計測体重（kg）÷身長（m2））を測定した。 多毛スコアはFerriman-Gallwey法（30）により、下腿部と前腕部を除いて評定した。
ホルモン評価は月経周期2～10日目、または無月経の患者には任意の日に実施した。 一晩絶食した後、LH、性ホルモン結合グロブリン（SHBG）、総テストステロンを測定するために、前十二指腸静脈から採血を行った。 採血はすべて午前8時から10時の間に行った。 FAIは、総テストステロン（nmol/l）をSHBG（nmol/l）×100で割ることによって推定された。SHBGは免疫化学発光測定法（ICMA; DPC, Los Angeles, CA, USA）で測定し、検出限界は0.2 nmol/l、アッセイ内およびアッセイ間のCVはそれぞれ5.0および8.0%であった。 LHはICMAで測定し、検出限界は0.7mIU/ml、アッセイ内およびアッセイ間のCVはそれぞれ5.2および8.0%だった。
RT-PCRプロトコル
すべての被験者の頭頂部から摘んだ褐毛を集め、すぐに液体窒素で冷凍しアッセイのために研究所に輸送された。 トータルRNAの抽出とcDNAの合成は、既報の通り行った(31)。 摘出した毛根をフェノール-グアニジンイソチオシアネート（Trizol，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA）中でホモジナイズした。 クロロホルムで全RNAを抽出し、イソプロパノールで4℃、12,000 g遠心分離して沈殿させた。 RNAペレットを75%エタノールで2回洗浄し、ジエチルピロカーボネート処理水に再懸濁し、260 nmの吸光度で定量した。
SuperScript Preamplification System (Gibco-BRL) を用いてすべての反応について5 μg total RNAから一本鎖cDNAを合成した。 鋳型RNAとプライマーを70ºCで10分間変性させた後、20 mM Tris-HCl, pH 8.4, プラス50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP mixおよび10 mM dithiothreitolの存在下で逆転写酵素を加え、42ºCで55分間インキュベートした。 混合物を70ºCに加熱して反応を停止させ、大腸菌RNaseと37ºCで20分間インキュベートし、未転写RNAを破壊した。 異なるPCRアッセイで使用される鋳型（cDNA）は、同じ逆転写反応から得られた。 PCRは、最終容量50 µlで実施した。 2 µl の第一鎖合成反応（予想 cDNA 収量 10 ng）を、20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl および 1.5 mM MgCl2 の存在下で 94ºC, 3 min （ß2-microglobulin のみ 2 min ）変性させた。 このホットスタートの後、1.25 UのTaq DNAポリメラーゼを、同じTris-HClバッファ、1.5 mM MgCl2、0.4 µMセンスおよびアンチセンスプライマー、0.2 mM dNTP mixと共に添加した。
SDR5A1 (24) cDNA配列の368bp断片とSDR5A2 (14)の566bp断片は、汚染されたゲノムDNAの増幅を防ぐために、イントロン-エクソンの境界をまたぐように設計したプライマーを用いて増幅させた。 また、各サンプルの cDNA 量を正規化するために、ユビキタスに発現するタンパク質 β2-microglobulin (32) に対応する 623-bp の cDNA 断片を増幅した。 SDR5A1 と SDR5A2 の cDNA 配列と β2 ミクログロブリンのプライマーを表 1 に示す。 PCRはサイクル数（20〜45）を試験して標準化し、直線範囲での増幅を行った。 最終的なPCR条件は以下の通りである。 SDR5A1 は 35 サイクル (45 s at 94ºC, 45 s at 60ºC, 90 s at 72ºC, 10 min at 72ºC), SDR5A2 は 40 サイクル (94ºC 1 min, 65ºC 1 min, 72ºC 2 min, 5 min at 72ºC), β2-microglobulin は30サイクル (94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 1 min at 72ºC, 5 min at 72ºC) であった。 全てのPCR反応において、陽性対照としてヒト前立腺の解離細胞からのcDNAを使用した。 陰性反応にはcDNAを添加しなかった。 PCR混合物のサンプル(15 µl)をエチジウムブロマイドで染色した1.5-2.0%アガロースゲルでサイズ分画し、100 Vで運転してUV光下で可視化した。 予想されるバンドは、画像処理システム（ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いたデンシトメトリー解析により定量化した。
統計解析
データは、特に断らない限り平均±SEMとして報告される。 グループの平均値は、Student t-testまたは一元配置分散分析（ANOVA）に続くDuncan testによって比較され、中央値はMann-Whitney testによって比較された。 差はP < 0.05で統計的に有意であるとみなされた。 すべての分析は、Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) を用いて行った。
結果
表2は、PCOSおよびIH患者の身体測定およびホルモンデータをまとめたものである。 年齢や多毛症の臨床スコアに関して、多毛症患者の2群間に有意差は認められなかった。 しかし、PCOS 患者では BMI が高く、テストステロン、FAI、LH の値が IH 患者に比べ有意に高かった。 3072>
SDR5A2遺伝子の発現は、本研究でRT-PCRにより分析したどの頭髪サンプルでも検出されなかった（図1）。図2は、正常者の頭皮から摘出した毛髪細胞におけるSDR5A1 mRNAレベルを示す。 SDR5A1の発現量は、β2-ミクログロブリン吸光度に対する任意の単位で示され、男性（0.78 ± 0.05）と健常女性（0.74 ± 0.06）で同程度であった。 さらに、毛包ケラチノサイトのSDR5A1発現は、正常女性（0.85±0.04）とPCOS（0.78±0.04）またはIH（0.80±0.06）の多毛群間で有意差を認めなかった（図3）
図1.多毛群での毛包のSDR5A1発現 男性（1〜9）、正常女性（10〜17）、多毛症患者の頭皮から摘出した毛髪細胞において、RT-PCRによるSDR5A2 mRNAの発現がないことを示すエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルの代表的な例。 PCOS群（18〜31歳）、IH群（32〜39歳）の頭皮から採取した毛髪細胞でRT-PCRを行い、SDR5A2 mRNAの発現を確認した。 566bpの断片はSDR5A2（5a-R2）に、623bpの断片はβ2-ミクログロブリン（β2-m）に対応する。 SDR5A2の増幅は、陽性対照（+）として使用した解離前立腺細胞でのみ可視化された。
図2． 男性（1〜7）および健常女性（8〜14）の頭皮から摘出した毛髪細胞において、RT-PCRにより測定したSDR5A1 mRNAレベルを示す代表的なゲル。 368bpの断片がSDR5A1（5a-R1）、623bpの断片がβ2-ミクログロブリン（β2-m）に対応する。 RT-PCR産物は、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上で可視化した。 + 3072>
図3. 正常女性（1〜14名）および両群の無毛症患者（PCOS：15〜26名、IH：27〜35名）の頭皮から摘出した毛髪細胞におけるRT-PCRにより測定したSDR5A1 mRNAレベルを示す代表的なゲルを示す。 368bpの断片はSDR5A1（5a-R1）に、623bpの断片はβ2-ミクログロブリン（β2-m）に対応する。 RT-PCR産物はエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上で可視化した。
Discussion
皮膚の5a-reductase活性は多毛症に関連しているが，この臨床発毛状態に関与するアイソザイムに特有の役割と同定はまだよく定義されている必要はない。 本研究では、多毛症患者の頭皮の前髪を摘出した毛母細胞における両方のタイプの5a-リダクターゼのmRNA発現を調べた。
SDR5A1遺伝子は正常者の頭皮の頂点から得た摘出毛母細胞で発現していることが判明した。 他の研究では、培養毛包ケラチノサイトでSDR5A1 mRNAを調査した場合でも、同様の結果が示されている(24,33)。 摘出された無毛の毛は、主に外根鞘と内根鞘の両方を形成するケラチノサイト細胞によって構成されている。 結合組織鞘、下球、毛乳頭細胞、皮脂腺はむしり取られた毛には存在しない。 したがって、我々のデータは、毛包ケラチノサイトにおけるSDR5A1の遺伝子発現を確認し、毛包の根鞘細胞における5a-還元酵素免疫反応性を示した他の研究（20、23）と一致する。
本研究において、摘出した頭皮毛からのSDR5A1 mRNAレベルは正常男女間で差がなかった。 また、これまでの研究で、男女の毛包における5a-リダクターゼ活性は同程度であることが報告されている(12,34)。 一方、陰部皮膚サンプルでは、正常男性において、正常女性よりも高い5a-リダクターゼ活性が検出された（1）。 これらの結果を総合すると、健常者では頭皮の毛包ケラチノサイトと陰部皮膚の線維芽細胞で5a-リダクターゼの制御が異なるようである。
頭皮の毛包細胞は多毛症の主な標的ではないようである。 しかし、多毛症患者の顔面からサンプルを採取することには、倫理的な困難がある。 さらに、多毛症がある場合の頭皮毛包細胞の分子機構については、文献報告が少ない(9)。 頭皮領域は、男女ともによく知られたアンドロゲン感受性部位であり、頭皮毛のサンプルを比較的容易に入手することができます。 したがって、頭皮から摘出した毛髪細胞におけるアンドロゲン代謝のいくつかの側面を調べることは、特に、より高い（PCOS）または正常な（IH）循環アンドロゲンレベルに内因的にさらされる被験者を比較することが可能な場合には、興味深いものです。 さらに、血清アンドロゲン値が高い患者（PCOS群）でも、IHや正常アンドロゲン値の患者と同じSDR5A1遺伝子発現を示した。 SDR5A1は皮膚で優勢なアイソザイムですが（14）、今回の結果は、循環しているアンドロゲンが頭皮の毛包ケラチノサイトにおけるSDR5A1遺伝子発現におそらく寄与しないことを示し、SDR5A1が頭皮皮膚の局所アンドロゲン代謝における主要アイソザイムではないことが示唆されました。 一方、5a-還元酵素阻害剤であるフィナステリドは、男性型脱毛の治療（35）だけでなく、IHにおいても有効性が証明されています（36,37）。 フィナステリドは経口活性阻害剤で、5a-還元酵素2型を優先的に阻害するが、1型アイソザイムも阻害し、ジヒドロテストステロンと3a-アンドロステンジオールグルクロニドの濃度を著しく低下させることがある。 アンドロゲン受容体への親和性、アンドロゲン作用、エストロゲン作用、黄体ホルモン作用、その他のステロイド作用はない(38)。 我々の結果と一致するように、これらの研究は、5a-reductase type 2がおそらく発毛プロセスおよび関連する臨床症状においてより重要な役割を持つことを示している。
今回の結果は、SDR5A2遺伝子が、男性、正常女性、毛深い患者のどの被験者の毛包ケラチノサイトにも発現していないことを示している。 これまでの研究で、SDR5A2のmRNAと酵素活性は毛乳頭細胞に優先的に局在することが報告されているが（39,40）、SDR5A2の免疫反応性は毛包のケラチノサイトにも認められた（20,22）。 これらの研究間のタンパク質発現の明らかな不一致は、少なくとも部分的には、定性的データの免疫組織化学的解析の方法の違いによって説明されるかもしれない。 本研究で報告されたSDR5A2遺伝子の発現がないことについては、より感度の高い遺伝子発現分析法、例えばreal time PCRによって、将来的にこの疑問が解明される可能性がある。 毛乳頭の細胞は摘出生検でしか得られないが、これは侵襲的でストレスのかかる方法である。 毛乳頭細胞は、毛包のアンドロゲンの直接の標的となり、毛母細胞、メラノサイト、ケラチノサイトの活動をパラクリンシグナルで制御することが示唆されているからである(10)。
頭皮の頂部領域の毛包ケラチノサイトにおけるSDR5A1遺伝子の発現は、健常男女と多毛症患者の間で観察される発毛の違いとは関係がないようである。 異なる部位の毛包細胞における5a-リダクターゼ遺伝子発現の制御に関するさらなる研究が、毛髪成長プロセスおよび関連疾患に対する興味深いアンドロゲン作用のメカニズムの解明に役立つと思われます。 Kuttenn F, Mowszowicz I, Schaison G & Mauvais-Jarvis P (1977). 多毛症におけるアンドロゲン産生と皮膚代謝． 内分泌学雑誌、75：83-91。
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