Analysis and description of stages of Aspergillus fumigatus biofilm formation using scanning electron microscopy

医学的には、アスペルギルス・フミガタスは免疫不全者の日和見病原体で、宿主の免疫状態によって疾患の重症度が異なり、死亡率は50-95％であるとされています。 この真菌は、爪の皮膚真菌症や真菌性角膜炎などの局所感染やアスペルギルス症などの侵襲性感染を引き起こし、入院患者における真菌感染症の2番目に多い原因となっています。 A. fumigatusの呼吸器への感染は、肺真菌症、侵襲性アスペルギルス症、侵襲性肺アスペルギルス症（IPA）、過敏性肺炎、喘息、免疫グロブリンEを介するアレルギー性鼻炎、慢性壊死性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ABPA）などを引き起こす可能性があります。 さらに、骨髄炎や心内膜炎を引き起こします。

A. fumigatus はバイオフィルムを形成し、これが最も重要な病原因子の1つである可能性があります。 また、ヒト気管支上皮細胞（HBE）、嚢胞性線維症気管支上皮細胞（CFBEC）、嚢胞性線維症患者においてもバイオフィルムの形成が報告されている。 カテーテルや人工器官における真菌のバイオフィルム形成は、院内感染症の発症に寄与している。 したがって、真菌感染症の持続は、真菌が多種多様な医療器具上にバイオフィルムを形成する能力を有するため、また、残存する細胞が重要な耐性機構を示すためであると考えられる。 宿主に定着したバイオフィルムに対する治療には、通常、毒性濃度の抗菌剤の投与が必要であり、推奨される治療には汚染された機器の除去が含まれるが、これは困難でコストがかかる作業である。 このため、真菌のバイオフィルムは臨床的にも経済的にも大きな問題である。

過去10年間、A. fumigatusのバイオフィルムについて、in vivo（マウスモデル、侵襲性肺アスペルギルス症患者、ヒト初代培養上皮）およびin vitro（ポリスチレン板）双方でいくつかの研究が発表されている。 一般に、これらの研究では、バイオフィルムの成熟段階とECMの化学組成が主であり、バイオフィルムの段階の画像は少ないが、これらのうちのどれかがバイオフィルム形成のすべての段階を記述していた。 したがって、我々のワーキンググループによる貢献とは異なる情報である。

本研究の最も重要な貢献は以下の通りである：i）A. のバイオフィルム形成におけるすべての段階を記述している。 fumigatusのバイオフィルム形成の各段階をin vitroで経時的に説明し、その段階をSEM画像でサポートしたこと、環境からと角膜潰瘍の患者からの2種類の分離株を分析したこと、これまでほとんど報告がなく、我々の知る限りAspergillus種で説明されていない微細菌（臨床分離株）と真菌構造についての報告、新しい地点でのバイオフィルム定着の分散段階についての説明である。

A.fumigatusの成熟バイオフィルム（28℃と37℃で24時間培養）の構造組織を分析するため、土壌から採取した株と真菌性角膜炎患者から採取した株の2株をSEMで調べた。 本研究で観察されたA. fumigatusのバイオフィルム形成の概要は，土壌からの分離株とクリニックからの分離株にかかわらず，これらのバイオフィルムは同様の挙動を示したが，培養温度により違いが見られた． 28 °Cでは、バイオフィルムは古典的な微生物増殖に見られるようなラグ期、指数期、定常期を示し、バイオフィルムの成長は遅く安定で、ECMの産生は少なく、菌の構造組織は単純であった（Fig. 1）。 37 ℃では、性能曲線はかなり変化したラグ（適応）相とログ（指数）相を示したが、これは高温での培養によるストレスへの反応と考えられる。したがって、37 ℃では生菌を維持するために適応相（ラグ）の減少が見られる。また、ログ相は不連続な増加を示し、両方の動作を伴うことから、適応反応であると考えられる . このように、成熟期の37℃では、菌糸構造は極めて組織化されており、これらは縮小・圧縮され、菌糸は太くなり吻合し、ECMは豊富に菌糸構造を覆い、取り囲み、強化していた（Fig. 3と4）。

今回、我々はSEMによりA. fumigatusバイオフィルム段階の証拠を提供することに成功した。 バイオフィルム形成時に観察された段階は以下の通りである：

付着、細胞共凝集、EPS生成

初期段階（図2/4 h）では、分生子は真菌細胞壁の構造成分間の静電気力の相互作用によってプレート表面に付着し、この引力は弱いため可逆的であった。 不可逆的で永久的な結合は、細胞表面に存在する特定の細菌アドヘシン、および基質と結合するEPS（バイオフィルム形成の初期段階で微生物が生産する、細胞同士や基質との接着に機能する物質で、タンパク質-糖質の複合体と糖タンパク質からなり、主に構造または接着機能を担っている）において広く説明されてきた。 アドヘッシンは、橋渡しやコロニー形成の開始など、細菌細胞同士の認識に関与している . 真菌のバイオフィルム形成における接着にもアドヘシンが関与していることが知られている。 Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis のバイオフィルムでは、バイオフィルム形成に関わる接着遺伝子群が存在し、この過程で重要な役割を果たすagglutinin-like sequence (ALS) familyは細胞表面の接着性糖タンパクの特徴を持つタンパク質をコードしている。 C. albicansに存在するALSファミリーには、多くの表面糖タンパク質をコードする8つの遺伝子（ALS1-ALS7とALS9）が含まれている。 A. fumigatusでは、分生子表面にRodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp, RodFpの6種類のハイドロフォビンが存在することが確認されている。 この疎水性は宿主細胞のタンパク質との接着を可能にし、これらのすべて、あるいは2〜3個において、ポリスチレン板の表面への接着とバイオフィルム形成過程の開始に関与している可能性がある. さらに、Gravelatらはこの真菌の相互作用について述べ、アドヘシンMedAがポリスチレンプレートへの付着、バイオフィルム形成、分生子遺伝子の発現を制御し、A. fumigatusの分生子形成過程にハード効果を持つことを見出した . 菌体アドヘシンや菌体-菌体間の相互作用による接着は、シグナル伝達の引き金となり、細胞の共凝集やEPS産生を促進すると考えられ、これらの事象はFig.2（4時間）に示されている。 同時に、EPSは細胞同士の緊密な結合により真菌のコロニー形成を促進する（図2（8-12時間））。

糸状菌の菌糸への発芽と発生

バイオフィルム形成には、感知され反応を起こすための細胞数の閾値が必要だが、これは特定の機能を持つ遺伝子発現制御機構である 。 A. fumigatusのバイオフィルム形成では、分生子発芽開始前の分生子表面は著しく疎水化されており、40 %の疎水性メチル基で構成されている。 A. fumigatusの分生子が発芽すると、疎水性のタンパク質性ロドレット層が破壊され、親水性の細胞壁成分である多糖類から本質的になる分生子内壁が露出する。 発芽した1個の胞子には疎水性の先端がある。 分生子は表面の疎水性を徐々に失い、その後、新しい成長点では疎水性の小胞子と親水性の多糖類が共存している。 図2に示すように、分生子から菌糸への発芽は生殖管の形成から始まり（8-12時間）、細胞壁の非常に親水性の性質を持ち、菌糸の成長を促進することが期待される。 構造成分としては、成熟したバイオフィルムに存在し、細胞を結合してバイオフィルムの構造基盤を形成するECM、EPSや多くの組織化した菌糸を含む（図2（24 h0））. ECM。 水は最も豊富な成分であり、バイオフィルム内では97%近くを占める。 この湿った環境では、秩序だった高分子ネットワークが存在する。 バイオフィルムにおけるEPSの主な機能は、接着、細胞凝集、凝集、保水、宿主防御や抗菌剤としての防護壁、有機化合物や無機イオンの吸収、酵素活性、栄養源、遺伝情報の交換、電子供与体や受容体、細胞成分の輸送、過剰なエネルギー保持の貯蔵、酵素の安定化、であることが説明されている。 真菌のバイオフィルムでは、これらの機能のすべてはまだ説明されていないが、その一部は研究されている。マトリックスの凝集力と接着力は、バイオフィルムの建築的・機械的安定性に寄与している。 真菌細胞はマトリックスに固定化され、細胞間通信を含む激しい相互作用で連続的に変化し、恒常的に調節される生態系として機能しており、これが細胞間をつなぎとめる接着剤の役割を果たしている . バイオフィルムの構造は、それを作る微生物とその生息域を取り巻く状況によって大きく変化し、臨床症状に関連した構造の違いも含まれる。 感染過程では、ECMは宿主からの保護や微生物による薬剤への耐性を支える。したがって、ECMは機械的な枠組みであるだけでなく、細胞の挙動を制御する役割も担っているのである。 マトリックスの疎水性タンパク質は、特定の細胞表面受容体と結合して、細胞とマトリックスの接着をもたらし、細胞の形状、移動、増殖、細胞の生存、代謝に影響を及ぼしている。 さらに、ECMは乾燥、紫外線、放射線、酸化、飢餓、捕食者や宿主の免疫防御、抗生物質などの環境からの刺激から細胞を保護する。 Fig. 2 (24 h)とFig. 3に見られるように、ECMは菌糸に付着して連続した鞘を形成し、多孔質であることも確認された（Fig. 2 (24 h））。 A. fumigatusのバイオフィルムでは、EPSは高度に構造化され、豊富に生産されており、真菌の構造を覆い、囲み、強化し、菌糸-菌糸構造を融合させる凝集剤として働いていた（37℃のみ）。 EPSは粘液状の外観で発生し、菌糸を完全に付着して覆い、吻合を起こし、水路の内腔を閉鎖する（図2（24時間）、図3、図4）。 私たちの研究グループは以前、A. fumigatusのバイオフィルム成熟段階について報告したが、その際にも同様の構造が観察された

いくつかのマイクロコンスーティアはEPSの化学組成（糖質ポリマー、DNAやタンパク質、脂質など）が知られているが、その他のものはまだ同定されていない。 A. fumigatusの表面は、α-1,3-グルカン、キチン、キトサン、ガラクトマンナン、ガラクトサミノガラクタン、メラニン、タンパク質で構成されている。 細胞壁の組成と構造組織は常に入れ替わっており、存在する多糖類は同じでも、その量と局在は生育条件や栄養環境によって変化する。 ここでは、A. fumigatusバイオフィルムの化学組成を、キチン、代謝活性、核酸に付着した蛍光色素のCLSMによる共局在化で観察し、さらに、これらが2つまたは3つ付着した場合には蛍光色素シグナルの重複が観察されることを示した（Fig.5）。 α1,3-グルカンのような多糖類の機能は、in vitroでの菌糸凝集やバイオフィルムでの菌糸凝集に優位な役割を果たすことから説明された。 ガラクトマンナンやガラクトサミノガラクタンなどのECMの他の多糖類も、菌の保護やそのバイオフィルム構造の表面への接着に関与していることが知られている。 細胞外DNA（eDNA）は、A. fumigatusの構造的・建築的な完全性を維持するECMバイオフィルムの重要な構成要素である。 eDNAは自己分解によって生成され、抗真菌剤耐性のレベルと有意に関連している（Fig.5）。 さらに、eDNAは遺伝子の水平伝播のリザーバーとなりうる。 eDNAは、A. fumigatusがキチナーゼを分泌することにより、真菌細胞から放出され、多糖類と共局在化することにより、より強固で耐性のある構造体を形成する（Fig.5）。 バイオフィルムでは、細胞壁の修飾が細胞壁薬物に対する耐性に本質的な影響を及ぼす。 A. fumigatusのマウスバイオフィルムモデルでは、抗菌薬の排出に関連する多剤耐性（MDR）排出ポンプAfuMDR4遺伝子において、ボリコナゾール処理で24時間後に有意に誘導された。 FUN1マーカーは、生きたコミュニティである代謝活動を明らかにした（図5）

菌糸体。 バイオフィルムは、協調的な細胞プロセスを反映する複雑な3次元（3D）構造を示した。菌糸の発達と拡大は、両温度でコンパクトな菌糸層ネットワーク、菌糸-菌糸の接着、吻合を含み、最適な空間配置-栄養分の流入と廃棄物の流出を提供し、したがってバイオフィルムを安定化するチャンネルを形成して、顕著であった（37℃ではこのチャンネルはより明白であった（図2. 2 (24 h)、3、4)。 また、これらの構造は、他の研究者によっても観察されている . 微小菌体 バイオフィルムの成熟初期には、臨床分離株ではmicrohyphaeのような不規則な真菌構造が観察された（Fig.4）。 このことは、A. fumigatusでは初めてであり、文献上では微小菌糸の記載が少ないことと関連性がある。 微小菌糸は細胞骨格が変化しており、壁が薄く、末端が曲がった短くて細い菌糸を形成している。 微小菌糸は高い酵素活性を持ち、成熟過程とそれに続くバイオフィルム段階の細胞分散に有利である。 特に、新しい分生子が発芽可能なバイオフィルム成熟期には、非同期的なバイオフィルムの発達が見られ、新しい菌糸の成長やカールなどの菌糸の変化が生じた（図4および図6）。 バイオフィルムの細胞分散は、環境の変化に対応して起こる。 これは、バイオフィルム本体から有害物質を除去する作用がある。 この過程で、内在するバイオフィルム細胞が新たな場所で拡散・増殖することになるが、これは複雑な分子事象によって支えられている 。 バイオフィルムは、極めて複雑で無数の機能を持つ、生きた細胞の保護膜とみなすことができ、まさに驚くべき生物学的構造物である。 バイオフィルムは、捕食や化学的攻撃から細胞を保護し、細胞内コミュニケーション、栄養の流れ、遺伝物質の伝達のための媒体を細胞内に提供する。 また、細胞が分散することで、環境中や宿主内の繁殖可能な他の場所に生存細胞が拡散し、その結果、持続が容易になる。 細胞の分散は、環境中の栄養分が乏しい場合に起こるので、生存のためのメカニズムである。 したがって、細胞分散は、遺伝的多様性を促進するためだけでなく、不利な生息地を逃れ、新しいニッチの開発を助け、新しい場所で微生物を持続させるためにも重要である .

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