Specimen Requirements and Procedure
ELISA is performed in polystyrene plates, typically in 96-well plates coated to bind protein very strong. ELISAの種類によって、検査には一次および/または二次検出抗体、分析物/抗原、コーティング抗体/抗原、緩衝液、洗浄液、基質/発色剤が必要となります。 一次検出抗体は、目的のタンパク質にのみ結合する特異的な抗体であり、二次検出抗体は、酵素結合していない一次抗体と結合する第2の酵素結合抗体である
ELISA免疫測定の完了には、主に4つの一般手順があります。 これらのステップは
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コーティング（抗原または抗体のいずれか）
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ブロッキング（通常はウシ血清アルブミンを加える）
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検出
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最終読み取り
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検出は、発色できる基質の添加により行われる。 ELISAの検出には、多くの基質が利用可能です。 しかし、最も一般的に使用されるのは西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）とアルカリホスファターゼ（ALP）である。 HRPの基質は過酸化水素であり、青色に変化する。 ALPは室温で15分から30分インキュベートした後、ニトロフェノールの黄色を測定し、通常P-ニトロフェニル-リン酸（pNPP）を基質として使用する。
上記の各4ステップの間に、リン酸緩衝塩（PBS）および非イオン洗剤などのバッファーを使用してプレートを「洗浄」し、結合しなかった物質を除去する。 各洗浄ステップでは、従う特定のプロトコルに応じて、ウェルを2回以上洗浄します。
ELISAプロトコルでは、通常、濃度の連続希釈液がプレートのウェルに入れられます。 測定後、連続希釈のデータから標準曲線を作成し、X軸に濃度、Y軸に吸光度をとり、logスケールでプロットします。
ELISAには大きく分けて4つのタイプがある。
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Direct ELISA（抗原コートプレート；抗体のスクリーニング）
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Indirect ELISA（抗原コートプレート；抗原・抗体のスクリーニング）
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Sandwich ELISA（抗体コートプレート；抗体・抗体のスクリーニング）
ELISA（抗原コートプレート；抗体のスクリーニング）
ELISA（抗原コートプレート；抗体はスクリーニング）
Competitive ELISA（抗体のスクリーニング）Direct ELISA
Direct ELISAも間接的ELISAもELISAプレートに抗原をコーティングするところから始まります。 最初の結合ステップでは、プレートに抗原を添加し、37度で1時間インキュベートするか、4度で一晩インキュベートすることもできます。 インキュベーションステップが終了すると、次のステップでは、未結合の可能性のある抗体をプレートから洗浄し、BSA、オバルブミン、アプロチニン、または他の動物性タンパク質などの薬剤を用いてELISAプレート上の未結合部位をブロックします。 この第2ステップは、プレートへの非特異的な抗体の結合を防ぎ、偽陽性を最小限に抑えるために重要である。 バッファー添加後、プレートを再洗浄し、選択した酵素標識一次検出抗体を添加します。 さらにプレートを1時間インキュベートします。
Direct ELISAでは、一次検出抗体は目的のタンパク質に直接結合します。 次に、結合していない抗体を取り除くためにプレートを再洗浄し、アルカリホスファターゼ（AP）や西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）などの基質/発色剤をプレートに添加すると、色の変化が起こります。 試料の色の変化は、APによる基質からのリン酸基の加水分解、またはHRPによる基質の酸化のいずれかによって起こる。 直接法では、二次抗体の交差反応がなく、間接法に比べて短時間で測定できるなどの利点があります。 欠点は、他のELISAに比べて感度が低いこと、反応コストが高いことです。
Indirect ELISAは、洗浄工程を追加することと、バッファーを除去した後に加える抗体の種類を除いて、手順はdirect ELISAと同じです。 Indirect ELISAでは、目的のタンパク質に付着する一次検出抗体と、一次抗体に相補的な二次酵素結合抗体の2種類の抗体を必要とします。 一次抗体を先に添加し、洗浄工程を経て、酵素結合二次抗体を添加し、インキュベートする。 この後は、洗浄ステップ、基質の添加、色の変化の検出など、直接法と同じステップになります。
間接法は直接法と比較すると、感度が高いことが特徴です。 また、使用できる一次抗体の数が多いため、安価で柔軟性があります。
Sandwich ELISA
サンドイッチELISAは、直接法や間接法とは異なり、プレートのウェルに捕捉抗体を塗布するところから始まります。 抗原が2層の抗体（捕捉抗体と検出抗体）に挟まれているため、「サンドイッチ」と呼ばれる。 捕捉抗体をプレートに添加した後、プレートを覆い、4℃で一晩インキュベートします。 コーティング工程が終了したら、プレートをPBSで洗浄し、BSAでバッファリング/ブロッキングする。 バッファー洗浄は、室温で少なくとも1～2時間行う。 最後に、抗原を添加する前に、プレートをもう一度PBSで洗浄します。次に、目的の抗原をプレートに添加して捕捉抗体に結合させ、37℃で90分間インキュベートします。プレートを再度洗浄し、一次検出抗体をプレートに添加して室温でさらに1～2時間インキュベートし、その後、バッファ洗浄を実施します。 その後、二次酵素標識抗体を添加し、さらに1～2時間インキュベートします。 プレートを再洗浄し、基質を加えて色の変化を生じさせます。 サンドイッチ ELISA は、すべての ELISA タイプの中で最も高い感度を有しています。 この種のELISAの主な欠点は、時間と費用がかかることと、「マッチドペア」（2価/多価抗原）と2次抗体の使用が必要なことです。
Competitive ELISAは、血清中の抗原に対する抗体の存在を調べる試験です。 このタイプのELISAでは、2つの特異的な抗体、酵素結合抗体と検査血清中に存在する別の抗体（血清が陽性である場合）を利用します。 2つの抗体をウェルに結合させることで、抗原との結合を競合させることができます。 色の変化があれば、酵素標識抗体は抗原と結合したため、陰性であることを意味します（試験血清の抗体は結合していません）。 色の変化がない場合は、検査が陽性であり、検査血清中に抗体が存在することを示します。 競合 ELISA 法は特異度が低く、希薄な検体には使用できません。 しかし、その利点は、試料の精製が少なくて済むこと、ある試料中の広範囲の抗原を測定できること、小さな抗原にも使用できること、変動が小さいことです
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