Enzymatic conversion of mRNA into double-stranded insert DNA can be accomplished by the number of different procedures. それらのすべては、逆転写酵素の作用とオリゴヌクレオチドを主体としたcDNAの合成を含んでいる。 その後、一般的に使用されている手順はかなり分岐しています。 第2鎖を合成する方法、クローン化可能なDNAを作るのに適した末端を作る手順がいくつかある。 これらの手順の主な目的は、ベクターDNAにライゲーションできるDNAへのmRNAの変換を高い収率で行い、できるだけ長いインサートDNAを構築することである。 以下のプロトコルは、市販の試薬のみを使用し、通常、良好な cDNA ライブラリーの作製に成功している。 基本プロトコルは、ブラントエンド cDNA を作成し、リンカーにライゲーションして、EcoRI のようなユニークな制限部位にクローニングする方法について説明しています。 代替プロトコルは、より少ない酵素操作で、方向性のあるcDNAライブラリーを構築できるバリエーションで、発現cDNAライブラリーを作成することを目的とする場合には特に望ましい。 Alternate Protocolは、オリゴ(dT)プライマー、XhoIエンドヌクレアーゼの制限部位、ブラントエンドcDNAの生成中に制限部位を保護するための(GA)20リピートからなるリンカープライマー（3’から5’への順に）を利用する。 個々のcDNA分子の内部XhoI部位は、第一鎖のヌクレオチドミックスに5-methyl-dCTPを取り込むことにより保護される。 得られた末端がユニークなcDNAは、5’末端にEcoRIアダプターをライゲーションし、XhoIで消化し、リンカープライマーによってcDNAに組み込まれた3’XhoIサイトを解除した後、EcoRI /XhoI消化ベクターにクローニングすることが可能である。 これらの変更により、基本プロトコールよりも大幅に速く、簡単な合理化された手順となった
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