Results and discussion
Jiang et al. で述べられている「オートファジックフラックス」アッセイはウェスタンブロット解析によりフリーGFPに対するポリQ-GFPの比変動を測定した緑色蛍光タンパク質（GFP）の定量レポーターアッセイのことである。 N末端GFPに結合したpolyQと遊離GFPの2つのタンパク質をコードするマルチシストロンレポーターコンストラクトが設計された。 ウイルス2A（v2A）配列を2つのタンパク質をコードする配列間のリンカー領域として配置し、1つのオープンリーディングフレームから2つの別々のタンパク質の定比翻訳を可能にした（図1a）
Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP multistronic reporter constructを用いて推定Q52、Q31およびQ10-GFP constructを生成する。 a Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP constructのベクターマッピングb このコンストラクトにおけるCAAおよびCAG変性コドン使用量の概要。 c グルタミンコーディングCAGおよびCAAトリプレットがランダムに配置されていることを示す構築物のクロマトグラフ。 d グルタミンリピートの数が少ないポリQ構築物を生成するためのQ80-GFP含有構築物のPCRベースの排除増幅の模式図である。 e Q52、Q31及びQ10プライマー結合部位を示すQ80配列。 f Q52、Q31及びQ10構築物の生成を意図したプライマーの配列。 g ポリQ領域を挟むプライマーを用いた推定Q80、Q52、Q31及びQ10ベクターのそれぞれについての分析用アガロースゲル電気泳動法。 意図した推定Q80、Q52、Q31およびQ10-GFP構築物について、それぞれ〜270、〜180、〜120および〜60bpのPCR産物サイズが見られた
80個のグルタミン反復（Q80）を含むポリQ配列の設計を行なった。 この配列は，グルタミンをコードするCAG三重項とグルタミンをコードするCAA三重項をランダムに配置することにより，繰り返し類似度が低くなるように設計した（図1b，c）。 ヌクレオチドの置換は、半ランダムなパターンを生成するように目視で行った。 この非反復配列設計は、バクテリア内での増殖中の配列安定性を高めるだけでなく、配列の特定領域にアニーリングするPCRプライマーの設計を可能にするはずであった。
上記のQ80-GFP-v2A-GFP構築物を商業的に合成し（Biomatik Corporation）（追加ファイル1参照）、BamHIおよびClaI制限部位を介して、川上研究室から入手できるTol2トランスポゾンベース、pT2AL200R150G遺伝子導入ベクター（以下Tol2という）へとサブクローン化した（図1参照）。 8074>
Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP コンストラクトのPCR による排除増幅により、より少ない数のグルタミンリピートを持つPolyQ コンストラクトを作製した。 プライマーは、目的のコンストラクトを生成するために、定義された数のグルタミンリピートを除いたベクターの周りを増幅するように設計された（図1d-f）。 我々は、約52 (Q52)、31 (Q31)、10 (Q10) のグルタミンリピートを持つベクターを生成することを目指した。 Q52とQ31のベクターは、同じリバースプライマーと異なるフォワードプライマーを用いて作製した。 この共通のリバースプライマーは2つのグルタミンリピートを増幅し、フォワードプライマーはQ52とQ31ベクターの生成に必要な追加の50と29のグルタミンリピートをそれぞれ増幅する。 Q10ベクターの増幅を最適化するために、リバースプライマーの位置をわずかにずらし、リバースプライマーが5つのグルタミンリピートを増幅し、フォワードプライマーが残りの5つのグルタミンリピートを増幅するようにした（図1d-f）。 PCR反応にストリンジェントなアニーリング温度を用いることで、特異的なプライマー結合を得ることができた。 ゲル抽出・精製したPCR産物をリン酸化し、自己ライゲーションにより環状化し、その後コンピテントセルに形質転換した（Additional file 3参照）。 ポリQ領域を挟むプライマーを用いたPCRでは、目的とする推定Q52、Q31、Q10ベクターについてほぼ予想通りの産物サイズを示した（図1g）。 生成された構築物は、予想されるpolyQ繰り返し数が存在するかどうかを決定するために配列決定された。 Q52コンストラクトは予想される数のグルタミンリピートを有していたが（図2a、b）、配列決定により他の2つのコンストラクトについては予想されるポリQ数とのわずかな不一致が明らかになった。 2c, d）、Tol2-Q10-GFP-v2A-GFPベクターは11個のグルタミンが繰り返されていた（以下、Tol2-Q11-GFP-v2A-GFPという）（図2e, f）。 さらに解析したところ、生成したQ21配列は元の配列に直接由来し、グルタミンリピートの消失はQ31フォワードプライマーが予測される結合部位から30bp下流に結合したためであることが判明した。 一方、Q11配列の追加のグルタミンリピートは、CAAコドンの追加というde novoの生成であった
PCRベースの切除増幅により生成したQ52、Q21およびQ11-GFPをコードする構築物のベクターマップと配列分析。 a Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP構築物のベクターマップ。b Q52構築物のクロマトグラフ。 c Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP構築物のベクターマップ d Q21構築物のクロマトグラフ e Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP構築物のベクターマップ。 f Q11コンストラクトのクロマトグラフ
生体内でのpolyQタンパク質の凝集動態と「オートファジックフラックス」を調べるために、生成したpolyQベクター（25 ng/μL）とトランスポザーゼmRNA（25 ng/μL）を1細胞期のゼブラフィッシュ胚群に注入した（図3a, b）。 受精後24時間（hpf）胚のライセート（1サンプルあたり10胚）について、抗GFP抗体によるウェスタンブロット解析を各グループについて行った。 空のTol2ベクター（25 ng/μL）およびトランスポザーゼmRNA（25 ng/μL）を注入した胚および注入していない胚を対照として含めた。 ポリQコンストラクトを注入した胚は、予想通り、抗GFP抗体によって検出される2つのバンドを生じた。ポリQに付着したGFP（ポリQ80-GFP：約48 kDa、ポリQ52-GFP：約38 kDa、ポリQ21-GFP：約33 kDa、ポリQ11-GFP：約31 kDa）と遊離GFP（〜27 kDa）である（図3c）。 各ポリQ-GFPコンストラクト発現胚ライセートは、全長ポリQX-GFP-v2A-GFPコンストラクトに対応する、より高いタンパク質サイズの淡いバンドも示した（ポリQ80-GFP-v2A-GFP：〜75 kDa、ポリQ52-GFP-v2A-GFP：〜65 kDa、ポリQ21-GFP-v2A-GFP：〜60 kDa、およびポリQ11-GFP-v2A-GFP：〜58 kDa）。 このバンドは、v2A配列システムを使用した場合、単一の完全長タンパク質として翻訳される全タンパク質の約10％を表している。 Q80-GFP：GFP、Q52-GFP：GFP、Q21-GFP：GFP、Q11-GFP：GFPの比率はそれぞれ、〜5、〜4、〜2、〜1である（図3d）。 v2A配列はpolyQ-GFPとGFPタンパク質の化学量論的翻訳を可能にするので、理論的にはpolyQ-GFP:GFPの比率は1になるはずである。 この比率が大きい場合、これらのタンパク質が蓄積している可能性がある。 これらの観察は、19以上のグルタミン残基を含むpolyQ-GFP融合コンストラクトが長さ依存的にトランスフェクト細胞内で凝集することが示されている文献と一致する。 これらの観察から、我々のTol2-QX-GFP-v2A-GFPコンストラクトは、幼生ゼブラフィッシュモデルにおいてin vivoで「オートファジックフラックス」を研究する有用なツールになると結論付けられる。
D. rerioにおけるTol2-QX-GFP-v2A-GFP構築物の発現の分析。 ゼブラフィッシュ胚に25ng/μLのTol2-QX-GFP-v2A-GFP構築物と25ng/μLのTol2トランスポザーゼをコードするmRNAを注入した。 a Q80、Q52、Q21およびQ11-GFPを発現するゼブラフィッシュ胚の頭部および体幹部領域の左側面図の明視野（上段）と蛍光（下段）画像、24 hpf頃まで。 b Q80、Q52、Q21、Q11-GFP を発現するゼブラフィッシュ胚の体幹および尾部の左側面画像の明視野（上段）および蛍光（下段）、〜24 hpf. c D. rerio における Qx-GFP 構築物の発現のウェスタンブロット解析。 Q80，Q52，Q21，Q11-GFPコンストラクトを発現している〜24hpf胚からタンパク質を単離した。 タンパク質は 10% SDS-PAGE ゲルで分離し，ニトロセルロース膜に移した。 この膜を抗GFP抗体でプローブした。 空」Tol2ベクターは、コンストラクト挿入時に置換される発現GFP遺伝子を有する。 d ウェスタンブロット定量。 ウェスタンブロットの各番号のバンドのGFP強度とQx-GFP／フリーGFP比を示す
結論
結論として、本研究は、意図した長さに近いポリQ反復を生成する堅牢で容易に採用できる解決法を提供するものである。 正確な数のグルタミン・リピートを生成するために、プライマー配列を変更した増幅を何度も行うことが可能である。 また、プライマーの長さを長くして、鋳型へのアニーリングの特異性を高めることも可能である。 本技術は、既存のPCRによる繰り返し領域の増幅法と比較していくつかの利点があり、遺伝暗号のコドンの冗長性を利用して、繰り返しの少ない同義のDNAコード配列を生成することにより、非特異的PCR産物と欠陥のある繰り返しの発生を最小限に抑えることを目的としている。 また、我々のアプローチはpolyQ反復配列の生成に限らず、他のヌクレオチド反復配列の生成にも一般化することが可能である。 さらに、我々の方法は比較的安価であり、最初のpolyQ80-GFP-v2A-GFP構築物のみが商業的合成を必要とし、そのコストはヌクレオチド塩基当たりの価格、長さ、純度および質量に依存する。 その他の必要な材料はすべて、分子クローニングに使用される標準的な試薬である。 要約すると、記載された技術は、必要に応じて操作することができる反復コード化DNA配列を生成するための、採用しやすく、手頃な価格のソリューションを提供する
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