- Hypoxia causes an expression in M. Smegmatis. smegmatis recA and recX genes
- ΔrecX and ΔrecA ΔrecX mutant strainの構築
- 遺伝子型および表現型分析によるM. M. smegmatis ΔrecXおよびΔrecAΔrecX変異体
- M. smegmatis ΔrecA および ΔrecA ΔrecX 変異株は野生株に対して成長障害と細胞収量の減少を示した
- recXではなくrecAの欠失は、M. smegmatisをDNA損傷剤に対してより感受性にする
- 異なる濃度のDNA損傷剤処理後の生存率
- recAとrecX遺伝子の発現はDNA損傷によって誘導される
- 使用した略語は
Hypoxia causes an expression in M. Smegmatis. smegmatis recA and recX genes
結核菌は感染・増殖の過程で、低酸素や酸性pHストレスなどの生理的ストレス状態にさらされ、生存を脅かされることがある38,39,40。 例えば、急性の低酸素ストレスは、DNA複製を停止させ、強固なDNA損傷を誘発する41,42,43。 DNA損傷に伴い、umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB, uvrDなどのSOS経路の遺伝子の発現増加が始まる44,45,46. このため，潜伏感染中のM. smegmatisやM. tuberculosisにおける低酸素による遺伝子発現プロファイリングは，潜伏結核菌の性質やその治療について貴重な知見を与えている47。5901>
M. tuberculosis48，Thiobacillus ferrooxidans49，Streptomyces lividans50におけるこれまでの研究により，recAとrecXは共起することが明らかにされている． さらに、Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52, Xanthomonas oryzae53などの特定の細菌種では、RecXがない場合、SOS応答の正の調節因子であるRecAの過剰発現は毒性を示すことが判明している。 これらの知見は、RecXがアンチ・レビナーゼとしてRecA14によって促進される不適切な組換え事象を抑制しているという考えと一致している。 一方、大腸菌ΔrecX株では、RecAを過剰発現させても劇症化せず、recXを欠失させてもrecAの発現に影響を与えないことが分かっている54。 大腸菌におけるrecXの転写は、recAとrecXのコード配列の間に転写終結部位が存在するため、通常の増殖条件下ではrecAに比べてダウンレギュレートされている。 しかし、転写のリードスルーによって生じるrecA-recX mRNA転写物は、recA mRNA総量の5-10%の範囲で蓄積される54。 大腸菌の植物成長期にはrecX転写体はほとんど検出されなかったが、DNA損傷剤で処理するとrecXが強く発現する15,55。
M. smegmatisとM. tuberculosisの両ゲノムには、単一のオペロンにそれぞれrecAとrecXが1コピー含まれている。 結核菌の代用モデルとしてよく用いられるM. smegmatisにおける好気的および低酸素的な成長下でのこれらの遺伝子の発現と制御を調べるため、様々な成長段階でのmRNAの相対量をRT-qPCRアッセイで測定し、構成的に発現する16S rRNA遺伝子のそれと正規化した。 M. smegmatis recAおよびrecX mRNAのサイクル閾値（Ct）値は、16S rRNA遺伝子のCt値に対して正規化された。 大腸菌15,55とは異なり、好気的および低酸素的な培養条件下で、対数期初期にかなりの量のrecA mRNA転写が見られた（Fig. 1A）。 興味深いことに、低酸素条件下では、recA mRNAの蓄積は対数増殖期中期に1.5倍に増加し、その後、細胞が定常期に入ると減少した。 好気的条件下と低酸素条件下の両方で、recX mRNAの蓄積量は減少しているものの、同様のパターンが観察された（Fig. 1B）。 これらの観察結果は、好気的および低酸素的な成長条件下で、2つの遺伝子が共転写され、協調的に制御されているという考えを支持するものであった。 興味深いことに、対数増殖期初期の好気的条件下と低酸素的条件下では、mRNAの量に差は見られなかった。 また、M. smegmatis成長期特異的マーカー遺伝子（sigH2、sigH7）56の転写プロファイルから、early-log期、mid-log期、stary期の時期を確認した（Fig. 1C）。 結核菌の多剤耐性臨床株では、recAとrecXの両mRNAのレベルが薬剤感受性株よりも高く、recA mRNAの上昇に伴ってrecX mRNAのレベルが上昇することが判明している57。
(A,B) M. smegmatis mc2155 recA, recX 遺伝子の好気的および低酸素的増殖条件における log 初期、log 中期および定常期の相対発現レベル。 (C) log初期、log中期、定常期におけるsigH2, sigH7遺伝子の相対的発現量。 シグナル強度は、方法セクションに記載されているように決定した。 ヒストグラムは、3つの独立した実験の平均値を表す。 発現量を測定し、16SリボソームRNAの発現量に正規化し、好気的な対数期初期の培養における転写物の量に対する誘導比を計算した。 エラーバーは、3つの独立した複製から計算した平均の標準誤差を表す。
ただし、mRNAレベルを対応するタンパク質レベルの代用として使用できないことに注意すべきである。 したがって、M. smegmatisにおけるRecAおよびRecXタンパク質の存在量は、抗RecAおよび抗RecX抗体を用いたウェスタンブロットアッセイによって、好気的および低酸素的条件下で測定された。 GroELはタンパク質負荷対照としてプローブした。 イムノブロットのデンシトメトリー解析により、細胞は好気的条件下と比較して低酸素成長条件下でより高いレベルのRecAを蓄積することが明らかになった（図2A,B）。 比較解析の結果、好気的増殖条件下では、細胞は常に対数期初期に比べて対数期中期に2倍高いレベルのRecAを蓄積し、定常期には対数期初期に見られるレベルまで減少した（図2A,B)。 RecXについても、RecAほど顕著ではないが、同様のパターンが観察された（Fig. 2A,C）。 mRNAとタンパク質の発現パターンは同程度であったが、重要な違いが認められた。 まず、RecXタンパク質は低酸素条件下ではlog期初期にほとんど検出されなかった。 図2
(A) M. smegmatis mc2155 RecAおよびRecXタンパク質の好気的および低酸素的増殖条件における発現レベル。 (B)好気的および低酸素的な成長条件下でのRecAタンパク質レベルの相対的な変化の定量化。 (C)好気的および低酸素的な成長条件下でのRecXレベルの相対的な変化の定量化。 ヒストグラムは、3つの独立した実験から得られたウェスタンブロットの定量化によって決定された平均値を表す。 RecAとRecXの発現レベルの正規化には、ローディングコントロールであるGroELを用いた。 エラーバーは、3つの独立した複製から計算された平均の標準誤差を表す。 有意差は**p < 0.01, *p < 0.05で示した。 ns, not significant.
これらの結果は、M. smegmatis recAおよびrecX遺伝子が低酸素条件下で誘導されることを示しているが、ログ初期段階のrecX mRNA量と対応するタンパク質量は相関がないことが示された。 M. tuberculosisとM. smegmatisはともに成長阻害条件下でmRNAの転写を安定化させることが示されている58,59,60。 考えられるメカニズムの中で、低酸素に反応するマイコバクテリアでは、tRNAの再プログラミングと選択的コドン偏重翻訳が役割を果たすことが示されている61。 また、recX mRNAとrecX protein levelの相関が対数期初期に見られないのは、recX mRNAの翻訳抑制による可能性がある
ΔrecX and ΔrecA ΔrecX mutant strainの構築
M. smegmatisにおけるrecAとrecX proteinレベルの違いは転写レベルでの遺伝子発現制御が可能なことを示している。 これまで研究された多くの細菌では、recX遺伝子はrecAの下流の同じコーディング鎖上に位置し、この2つの遺伝子は共転写される48,50,53,54,62,63。 しかし、Xanthomonas病原体のlexA-recA-recX遺伝子座では、それぞれの遺伝子が独自のプロモーターから発現している64。 さらに、D. radiodurans65,66, B. subtilis67, N. gonorrhoeae26では、recAとrecX遺伝子は長さが数百kb離れており、それぞれのプロモーターから転写される。
多くのマイコバクテリア種や他のいくつかの細菌では、recXコード配列の5´領域がrecA遺伝子の3´領域とオーバーラップしている。 M. smegmatis48では32bpの長さであるが，M. tuberculosis68とM. leprae69では35bpの長さでオーバーラップしている． recXの欠失が表現型に及ぼす影響については、様々な生物で研究されている7,10。 RecXのノックアウト変異体はRecAの機能に関連した様々な表現型を示す。B. subtilis recXの不活性化は細胞をMMSとH2O225に感受性にし、S. lividans recX変異体は紫外線損傷に対する抵抗性の低下を示し42、N. gonorrhoeae recX変異体は二本鎖切断によって生じるDNA損傷に対する生存能力がわずかに低下していた26。 しかし、recAとrecXの両遺伝子の欠失が増殖特性やDNA損傷修復に与える影響については、これまでどの生物においても検討されていない。 さらに、マイコバクテリアにおけるrecXの生体内での役割の完全な理解はなされていない。
これまでの研究で、M. smegmatis ΔrecA株は紫外線誘発DNA損傷に感受性を示し、HR52を促進しないことが明らかにされている。 我々はrecA変異とrecXの欠失を組み合わせ、二重変異の影響を調査した。 この目的のために、M. smegmatis mc2155 recX single mutant strainとrecArecX double mutant strainを作製した。 対照として、M. smegmatisにおけるrecA欠失の影響を直接比較するために再評価した。 M. tuberculosis と M. bovis BCG28 のために開発されたプロトコルに基づく組換え法を用いて、M. smegmatis mc2155 ΔrecA と ΔrecAΔrecX 変異体はそれぞれ 3.279 kb と 3.302 kb 直鎖 ΔrecA::hyg および ΔrecAΔrecX::hyg AES 構築物を用いて作成された。 それぞれのプラスミドをEcoRVで制限消化することにより、約100 ngの直鎖状AES DNA断片を生成した(Fig. 3A)。 これらをコンピテントM. smegmatis mc2155:pJV53 recombineering cellsに形質転換した70。 4-5日培養後、ΔrecX変異体およびΔrecAΔrecX変異体について8-10個のHyg耐性コロニーが見いだされた。 この推定される変異株をPCRでスクリーニングし、recXとrecArecX遺伝子が染色体から欠失したかどうかを判定した（データは示さず）。 正しい変異体を7H10ミドルブルック寒天培地で5〜8世代培養し、pJV53の消失を可能にした。
M. smegmatis mc2155 ΔrecX および ΔrecA ΔrecX 突然変異株の単離。 (A) M. smegmatis recA recX, ΔrecAΔrecX, ΔrecX 領域の物理地図。 両端に矢印の付いた横線は、野生株、ΔrecA ΔrecX株、ΔrecX株に対応するNdeIおよびSalI制限部位間のゲノムDNA断片の大きさを示す。 稲妻のシンボルは、指定された制限酵素の認識部位を示す。 小さな黒い箱（NdeI認識部位に隣接）は、サザンブロッティング実験に使用したハイブリダイゼーションプローブを示す。 (B)野生株およびΔrecX株のゲノムDNAのサザンブロット解析。 レーン 1 および 4 は分子量マーカー、2 は野生型株のゲノム DNA、3 は ΔrecX 株のゲノム DNA。 (C)野生株とΔrecAΔrecX株のゲノムDNAのサザンブロット解析。 レーン1：分子量マーカー、2：野生型株のゲノムDNA、3：ΔrecAΔrecX二重変異株のゲノムDNA。
遺伝子型および表現型分析によるM. M. smegmatis ΔrecXおよびΔrecAΔrecX変異体
PCRによるスクリーニングの結果、M. smegmatis mc2155のΔrecXおよびΔrecAΔrecXノックアウト変異体を各2体得た。 ΔrecX変異体およびΔrecAΔrecX変異体は制限酵素マッピングおよびサザンブロットハイブリダイゼーションによって特徴付けられた（Fig.3）。 適切な放射性標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、野生型M. smegmatis mc2155細胞の場合、4.1 kbの断片が見られた。 また、ΔrecX変異体では3.14 kb、ΔrecAΔrecX変異体では2.09 kbの予測される断片が観察された（Fig. 3B、C）。 これらのバンドはいずれも4.1 kbより小さく、recXとrecArecX遺伝子が対立遺伝子置換により欠失したことを示している。 recXとrecArecXに関する対立遺伝子交換の頻度はそれぞれ70%と80%の範囲であった。
この解析の一つの注意点は、ΔrecXとΔrecAΔrecX変異の観察された効果はハイグロマイシン耐性遺伝子挿入の極効果から生じる可能性があるという点である。 一般に、recA-recX遺伝子座周辺の遺伝子変化は、recA-recX遺伝子座の下流にある遺伝子の発現に極性効果をもたらすと考えられている。 2つの独立した実験を行い、潜在的な極性効果を調べた。 まず、ΔrecX変異体およびΔrecAΔrecX変異体をrecAおよびrecX遺伝子の機能コピーで相補化した。 この形質転換体は、標準培地で増殖する能力、および紫外線照射から変異細胞を保護する能力を評価した。 10倍連続希釈液を7H10寒天培地プレート上にスポットし、分析した。 図4A,Bに示すように、野生型recAは、ΔrecAおよびΔrecAΔrecX変異株を部分的に相補し、その増殖支援能力および紫外線照射に対する保護能力から推測されるとおりであった。 しかし、野生型recXは、紫外線照射によるDNA損傷誘発で観察されるΔrecAΔrecX変異株の表現型を救済することができなかった。 また、recXの欠失は正常およびDNA損傷条件下での生育に明確な影響を与えず、ΔrecXおよびその相補型株は野生型と同様の生育を示した。
M. smegmatis mc2155 recA-recX locusへのハイグロマイシン耐性遺伝子の挿入は極性を及ぼさない。 precAとprecXは、Hsp60構成的プロモーターの制御下でrecAまたはrecX遺伝子のいずれかの機能的コピーを有するpVV16-vectorを示す。 EVはpVV16空ベクターを示す。 precAおよびprecXは、それぞれM. smegmatis recAおよびrecX遺伝子の野生型コピーを有するプラスミドを示す。 これらは、指定された野生型株および変異型株に形質転換されている。 M. smegmatis mc2155ΔrecA ΔrecX および ΔrecX 変異株の好気的増殖（パネルA）および紫外線照射に対する感受性（パネルB）を、M. smegmatis recA または recX の野生型アレルを有するプラスミドで相補したものである。 (C), M. smegmatis mc2155野生株および変異株のrecA-recX遺伝子座周辺遺伝子の定量的リアルタイムPCR解析. エラーバーは、3回の独立した複製から算出した平均の標準誤差を表す。 5901>
次に、M. smegmatis mc2155野生株と変異株の2つの遺伝子の発現を評価し、有意な差はns（有意ではない）で示した。 smegmatis mc2155 の遺伝子、recA recX 遺伝子座の下流に位置する gluD (MSMEG_2725) と glnH (MSMEG_2726) を野生株と比較した ΔrecA ΔrecX と ΔrecX 変異株で示した。 陽性対照として、recA-recX遺伝子座の上流に位置するM. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720)遺伝子を使用した。 野生株、ΔrecA ΔrecX 変異株、ΔrecX 変異株から total RNA を調製した。 遺伝子転写物の相対量は定量的RT-qPCRによって決定し、構成的に発現している染色体16S rRNA遺伝子の相対量に正規化した。 発現量は指数関数的成長期後期に成長した細胞から測定した。 いずれの場合も、上流および下流のORFの遺伝子発現プロファイルは、野生株と変異株で同様であった（Fig. 4C）。 これらの結果から、ハイグロマイシン耐性遺伝子の挿入が極性効果を引き起こす可能性は否定できない。
M. smegmatis ΔrecA および ΔrecA ΔrecX 変異株は野生株に対して成長障害と細胞収量の減少を示した
M. smegmatis の特徴を明らかにするために、変異株と野生株とを比較検討したところ、野生株では細胞収量が減少し、ΔrecX 変異株では成長障害が見られた。 smegmatis ΔrecXおよびΔrecA ΔrecX変異株の特徴について、7H9 Middlebrookブロスを用いて37℃で野生株とノックアウト株の増殖プロファイルを測定した（Fig.5）。 recX欠失株は、M. smegmatis の増殖に（野生株と比較して）明確な影響を与えなかった。 このことから、recAがM. smegmatis の増殖と生育に関与していることが示唆された。 さらに、これらの結果は、停止または崩壊した複製分枝の救助におけるRecAの既知の機能と一致する71,72,73。 recAとrecX遺伝子は単一のオペロンを形成しているため、それらの欠失がM. smegmatis増殖に及ぼす影響を調べたところ、recAとrecXの欠失はM. smegmatis増殖に影響を及ぼさなかった。 ΔrecA ΔrecXノックアウト株はΔrecA変異体と野生株の中間の増殖表現型を示したが、対数期後半と定常期における増殖はΔrecAと野生株のそれとほぼ同じであった。
M. smegmatis mc2155 wild-type, ΔrecA ΔrecX, ΔrecX strainの通常の成長条件下での成長のキネティクスである。 各データポイントは3つの独立した実験の平均値であり、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
recXではなくrecAの欠失は、M. smegmatisをDNA損傷剤に対してより感受性にする
他の真核菌と同様に、マイコバクテリアRecAタンパク質はDNA損傷時のSOS応答を調節する上で重要な役割を演じる74、75、76、77。 recArecXとrecXの欠如がM. smegmatisが損傷したDNAを効果的に修復する能力に影響を与えるかどうかを調べるために、変異体をDNA損傷のメカニズムが異なる様々な薬剤に曝した。 これらの実験では、ΔrecA, ΔrecX, ΔrecX 変異株を菌体増殖の指数関数期（OD600 0.6）に紫外線照射、MMS、H2O2、シプロフロキサシンに暴露することによりストレスを誘発させた。 3時間培養後、細胞を洗浄し、培養物の10倍連続希釈液をハイグロマイシン（100 µg/ml）を含むMiddlebrook 7H10寒天培地プレート上にスポットして生存率をアッセイした。 DNA損傷剤の最適な濃度/投与量は、プレートアッセイを使用して菌株間の細胞生存率の差を評価した後に決定された。 DNA損傷剤非投与の場合、いずれの菌株も同程度の細胞生存率を示した（Fig.） 一方、DNA損傷剤存在下では、ΔrecA株は野生型株に比べて100倍以上の増殖不良を示し、プレーティング効率も低下した。 この表現型は、利用可能な文献と一致している。 一方、H2O2ではなく、UV、MMS、シプロフロキサシンの致死効果は、recX遺伝子の欠失によりΔrecA株では部分的にブロックされた。 H2O2効果がない根拠は明らかではないが、使用した濃度は成長に影響を与えるほど高くはなかったと思われる。 興味深いことに、ΔrecX株はΔrecA ΔrecX株よりも4種類のDNA損傷剤に対してわずかに抵抗性の表現型を示し、recX遺伝子の欠損による機能獲得の可能性が示唆された。 これらの結果から、recAがSOS応答に積極的な役割を果たし、ΔrecX株ではDNA損傷剤に対する感受性がわずかに抑制されていることが明らかとなった。
M. smegmatis mc2155 wild-type, ΔrecA ΔrecX, ΔrecX株の生存に対するDNA損傷薬剤の影響。 プレートに照射した。 (A) 5 J/m2 の紫外線、(B) 0.01% MMS、(C) 1 mM H2O2、(D) 5 μM ciprofloxacin。 対照は、DNA損傷剤を含まない株の増殖を示す。 結果は3つの独立した実験からの代表データ（n = 3）である。
異なる濃度のDNA損傷剤処理後の生存率
Mycobacteria には、酸化的、栄養的、薬剤誘発ストレスなど多くの有害ストレス状況がある78、79、80、81、82。 さらに細胞生存率の違いを探るため、細胞生存率をコロニー形成単位 (CFU) で測定する実験を行った。 まず、M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX, ΔrecAΔrecX 変異体を、濃度を上げてMMSで刺激し、野生型と比較して生存率をテストした。 MMSの濃度を変化させながら、OD600が0.6になるまで培養した。 7H10寒天培地上に所定数の細胞をプレーティングし、細胞生存率を測定した。 細胞は、分裂してコロニーを形成することができれば、生存していると判断された。 変異体は、野生株と異なり、濃度依存的にMMSに対する感受性が上昇した。 定量分析の結果、ΔrecA変異体はMMSに対して比較的高い感受性を示し、MMSの濃度が高くなるにつれて感度が上昇した（Fig. 7A）。 ΔrecXの場合、ΔrecA細胞に比べてMMSに対する感受性が〜2倍低かった。 一方、ΔrecA ΔrecX 変異体では、ΔrecX 変異体とは対照的に、MMS に対してより高い感受性が示された。 ΔrecX変異体のMMSに対する感受性は、recXがRecAに加えてまだ知られていない標的を持っている可能性を示している。
Survival of exponential-phase cultures exposed to broad range of increasing concentration of DNA damaging agents.（「DNA障害物質による指数期培養の生存率」、以下同じ）。 M. smegmatis野生型、ΔrecA、ΔrecA ΔrecX、ΔrecX株の生存率をCFU数の測定により調査した。 (A), MMS; (B) H2O2; (C) UV照射, (D) ciprofloxacinで処理した細胞の生存率。 エラーバーは、3つの独立した複製から計算された平均の標準誤差を表す。 有意差は、*p < 0.05; **p < 0.01 および ***p < 0.001 で示した。 ns, not significant.
次に、感受性の高いM. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX, ΔrecA ΔrecX変異株を高濃度のH2O2に曝して、野生株に対する感度を測定した。 その結果、ΔrecA変異体はこの処理に対して感受性が低いことがわかった（Fig. 7B）。 recXの単独欠失やrecA-recX遺伝子座の欠失は、H2O2処理に対する変異体細胞の生存率や増殖にわずかな影響を与えるだけであった。 注目すべきは、ΔrecAおよびΔrecAΔrecX変異株が、UV照射およびシプロフロキサシンに対して、MMSやH2O2よりも有意にはるかに厳しい感受性増殖表現型を示したことである（図7C,D）。 さらに、ΔrecA株はΔrecA ΔrecX二重変異株よりも紫外線照射とシプロフロキサシンに対して高い感受性を示した。
recAとrecX遺伝子の発現はDNA損傷によって誘導される
recA遺伝子上流の調節要素はすべてのマイコバクテリア種で保存されていない。 例えば、M. tuberculosisのrecA遺伝子は2つのプロモーターから転写される：両者は異なるメカニズムではあるが、DNA損傷誘導性である。 M. tuberculosis recAのプロモーターP1（開始コドンの近傍）は、LexAおよびRecAタンパク質とは無関係に、DNA損傷後に誘導されることができる。 一方、プロモーターP2（recA開始コドンから離れた位置）はLexAによって制御され、これは大腸菌のrecAプロモーターと機能的に類似している83,84,85。 興味深いことに、結核菌のDNA損傷誘導機構は、M. smegmatisでは完全に保存されていない46,75。 これらの知見は，M. smegmatis recAおよびrecX遺伝子の発現と制御，ならびにDNA損傷剤に対する応答におけるそれらの役割を理解する必要性を強調している。
上記のように，低酸素はM. smegmatis recAおよびrecX遺伝子の発現を増加させた（図1）。 M. smegmatis recAおよびrecX遺伝子の発現が損傷誘導性であるという概念をさらに裏付けるために、DNA損傷の有無による誘導の動態をRT-qPCRを用いて決定した。 紫外線照射後0、3、6、9、12時間目に採取したM. smegmatis細胞、および未処理の培養物から全RNAサンプルを調製し、「方法」のセクションに記載したように分析した。 その結果、未処理細胞ではrecAとrecXの転写レベルに有意な差は見られなかった。 一方、紫外線照射3時間後にrecAとrecXのmRNA転写産物の顕著な増加が観察され、その後わずかに減少した。 RT-qPCRのデータを比較すると、recAとrecXの転写レベルの間に重要な違いがあることがわかる。 紫外線照射により、recA mRNAはコントロールの約8倍、recXは約3倍に増加した（図8A,B）。 したがって、recAとrecX mRNAは同じ転写単位に存在するが、これらの結果は、recX mRNAの転写産物および/または安定性は、追加の転写後調節機構に従うという考えを支持する。
UV照射によるrecA、recX発現誘発M. smegmatisにおける。 (A)コントロールと紫外線照射後のrecA mRNAの蓄積の動態、(B)コントロールと紫外線照射後のrecX mRNAの蓄積の動態。 (C) 対照群と紫外線照射したM. smegmatis細胞におけるRecAおよびRecXタンパク質の蓄積の動態を示す代表的なウェスタンブロット。 (D,E)パネルCに示したウェスタンブロットデータの定量。エラーバーは、3つの独立した複製から算出した平均の標準誤差を表す。
これらの結果を受けて、DNA損傷の有無を問わずM. smegmatis細胞におけるRecAおよびRecXタンパク質の蓄積の動力学を決定すべく、追加の実験を行うこととなった。 RecAとRecXに対して上げたポリクローナル抗体を用いて、全細胞ライセートに対してウェスタンブロッティングアッセイを行った（図8C）。 ウェスタンブロットの定量から、未誘導の細胞では、RecAとRecXの両方のタンパク質がかなりの量含まれていることがわかった（図8D,E）。 それに比べて、紫外線照射3時間後の細胞では、RecAとRecXの両方の存在量が（コントロールに比べて）2倍も増加し、その後は減少していることがわかった。 重要なことは、RecAとRecXタンパク質の誘導が、低酸素条件下の細胞で見られるパターンを彷彿とさせることである（図2）、DNAを損傷するメカニズムは異なると考えられる。 我々の知る限り、M. smegmatis recAおよびrecX遺伝子の発現を活性化する刺激は同定されていない。 本研究では、好気的増殖時および様々なストレス条件下での細胞におけるこれらの遺伝子の発現量を評価した。 M. smegmatisでは、多くの細菌種と同様に、recAとrecXは同じオペロンに属し、recX遺伝子はrecA遺伝子のすぐ下流に位置し、重複するコード領域を共有する86。 DNA損傷剤によって両遺伝子の発現が異なる程度に誘導されるが、その発現比率は類似のパターンを示すことが判明した。 興味深いことに、好気的な成長条件と比較してストレス条件下ではRecAとRecXの両方のレベルが高いままである。
いくつかの研究は、RecAが促進する組換えDNA修復におけるRecXの別の役割を実証している。 RecXタンパク質はRecAと物理的に相互作用し、多くの細菌種で知られている後者のすべての機能の強力な阻害剤として機能する一方で、N. gonorrhoeaeとB. subtilisにおいて相同組換えを増強する25,26。 マイコバクテリアのストレス応答におけるrecXの役割を明らかにするために、M. smegmatis recXおよびrecArecXのノックアウトミュータントを構築した。 興味深いことに、M. smegmatisにおいてrecXを欠損させると、4種類のDNA損傷剤すべてに対してわずかに抵抗性の表現型となり、recX遺伝子の欠損による機能獲得の可能性が示唆された。 この効果の分子的根拠は明らかではないが、今後の研究によって明らかにする価値があると思われる。 今回の解析では、主に組換えDNA修復経路におけるrecAとrecXの遺伝的相互作用に焦点を当てたが、興味深いことに、recXは細菌の増殖に重要な役割を担っているようであった。 これらの知見は、M. smegmatis recXが悪条件下でのDNA修復/組換えプロセスにおいて重要な役割を果たし、おそらく未知の遺伝子のサブセットの有害な作用を制御しているという考えと矛盾しない。
使用した略語は
DTT、ジチオスレイトール；EDTA、エチレンジアミン四酢酸；kb、キロベース；MMS、メチルメタンスルホン酸；ODN、オリゴヌクレオチド；PAGE、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；。 PVDF、ポリフッ化ビニリデン膜；RT-qPCR、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応；SDS、ドデシル硫酸ナトリウム；ssDNA、一本鎖DNA；SSC、0.15 M NaCl-0.015 M クエン酸ナトリウム (pH 7.0) バッファー
。