- Signaling through intrinsic pathway of apoptosis
- Mitochondrial mediators of caspase-dependent apoptosis
- Cytochrome c
- Smac/DIABLO
- Mitochondrial mediators of caspase-independent apoptosis
- Disruption of the intrinsic pathway in cancer
- Signaling through the intrinsic pathway in cancer therapy
- Smac/DIABLO アゴニスト
Signaling through intrinsic pathway of apoptosis
In mitochondrial pathway of apoptosis.Oncogene.Inc, カスパーゼの活性化は、Bclファミリーのプロアポトーシスメンバーによるミトコンドリア外膜の透過化と密接に関連している(Green and Kroemer, 2004)。 数多くの細胞毒性刺激とプロアポトーシス信号伝達分子がミトコンドリアに集中し、ミトコンドリア外膜の透過化を誘導する(Decaudinら、1998;GreenとKroemer、2004年)。 この透過化は、Bcl-2ファミリーからのタンパク質、ミトコンドリア脂質、生体エネルギー代謝物フラックスを制御するタンパク質、および透過性転移孔の構成要素によって制御される(Green and Kroemer, 2004)。 ミトコンドリア外膜が破壊されると、通常はミトコンドリア内膜と外膜の間の空間に存在する、シトクロムc、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2、AIFおよびエンドヌクレアーゼGなどの一連のタンパク質が放出される(Saelens et al.、2004年)。 細胞質内に入ると、これらのアポトーゲン蛋白質は、カスパーゼの活性化を促進することにより、あるいはカスパーゼ非依存性の死エフェクターとして作用することにより、細胞死の実行の引き金を引く(Saelens et al,
Mitochondrial mediators of caspase-dependent apoptosis
Cytochrome c
ミトコンドリアからのシトクロムcの放出は、シトクロムc/Apaf-1/カスパーゼ9含有アポプトソーム複合体の形成によりカスパーゼ3の活性化を直接引き起こす (Cain et al., 2000). 細胞質に入ると、シトクロムcはApaf-1のC末端領域に結合する。Apaf-1は細胞質タンパク質で、N末端のカスパーゼリクルーティングドメイン(CARD)、線虫CED-4に相同性のあるヌクレオチド結合ドメイン、12-13WD-40反復を含むC末端ドメインを持っている(Zou et al.、1997)。 シトクロムcとApaf-1の結合により、dATPとApaf-1の結合が促進され、N末端のCARDが露出する。CARDはオリゴマー化し、プラットフォームとなり、CARD-CARD相互作用により開始因子カスパーゼ9が集められ活性化される(Adrain et al, 1999)。 続いて、実行役のカスパーゼ3がアポプトソームに集められ、そこで常駐するカスパーゼ9によって活性化される(Bratton et al.、2001)。
ある場合には、合成カスパーゼ阻害剤およびApaf1 -/-細胞の使用によって示されたように、細胞質シトクロムcによって引き起こされたカスパーゼ活性は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の低下に寄与する(Waterhouseら、2001年)。 さらに、カスパーゼ活性は、複合体IおよびIIの活性に影響を与えることによって透過したミトコンドリアの機能をさらに損傷し、必然的にMMPの損失および活性酸素種の発生をもたらす(Ricciら、2004年)。 このように、シトクロムcや他のミトコンドリアIMSタンパク質の放出によって引き起こされる細胞質変化から生じる二次的な事象は、透過型ミトコンドリアにフィードバックし、その機能に影響を与えることが可能である。 重要なことは、このカスパーゼ活性のミトコンドリア増幅ループが、細胞毒性治療に対する癌細胞の反応を決定的にする可能性があることである。
さらに、カスパーゼ活性化には、シトクロムcおよびアポトーソームに依存せず、Apaf-1に依存するメカニズムが存在するという最近の証拠が存在する。 アポトーゲン活性を持たないが、電子伝達と抗酸化活性を持つチトクロムcの変異体(K72A)の標的ノックインにより、酸化的リン酸化におけるチトクロムcの機能に影響を与えずにアポトーシスへの寄与を評価することができた(Hao et al, 2005)。 興味深いことに、KA/KAマウスの胸腺細胞は、Apaf-1(-/-)胸腺細胞に比べて、エトポシドやγ線照射などの死刺激に対して著しく感受性が高かった(Hao et al.、2005年)。 γ線照射により、アポトーシスを起こしたKA/KA胸腺細胞ではプロカスパーゼが効率よく活性化されたが、Apaf-1のオリゴマー化は観察されなかった(Hao et al,
Smac/DIABLO
Smac/DIABLO や Omi/HtrA2 などのミトコンドリアから放出されるタンパク質は、アポトーシス阻害タンパク質 (IAPs) である内因性のカスパーゼの阻害物質を中和することによって、カスパーゼの活性化を促進させることが分かっている。) SmacとそのマウスホモログであるDIABLOは核にコードされたミトコンドリアタンパク質であり、ミトコンドリア局在シグナルを持ち、このシグナルはミトコンドリア輸入時にタンパク質分解的に除去されて成熟した23kDaタンパク質となる(Duら、2000; Verhagenら、2000)。 この成熟段階により、Smac/DIABLOのN末端にはIAP結合モチーフ(IBM)が露出する(Duら、2000年)(表1)。 2番目のミトコンドリア由来のカスパーゼ活性化因子/DIABLOは、XIAP、cIAP1、cIAP2、サバイビン、アポロンとBIR依存的に結合し(Vaux and Silke, 2003)(図2)、IBMが二価で存在するホモダイマーとして働くことが示されている(Chai et al.、2000)。 1つのSmac/DIABLO二量体は、両方のIAP結合モチーフによって1つのXIAP分子に結合し、一方はBIR2に、他方はBIR3に相互作用する(Huangら、2003年)。 興味深いことに、同じBIR3の溝は、カスパーゼ9の小サブユニットのAsp315以降の自己触媒処理後にN末端に露出するIBM(Ala-Thr-Pro-Phe)と結合し、Smac/DIABLOがカスパーゼ9をXIAPから置き換えることを可能にしている(Srinivasula et al, 2001)(表1)。
Smac/DIABLOの生理的ミトコンドリア機能は不明で、DIABLO -/-マウスは正常に見える(岡田ら、2002)。 Smac -/-細胞の溶解液ではシトクロムc添加によるin vitroでのプロカスパーゼ-3の切断が阻害されたが、Smac -/-マウスおよび細胞は紫外線照射、スタウロスポリン、エトポシド、TNF/シクロヘキサミドなどのアポトーシス刺激に正常に応答した(Okada et al.、2002年)。 これらの観察から、Smac/DIABLOの欠損を補う冗長な因子、おそらくHtrA2/OMIの存在が示唆される。
Omi/HtrA2 は核にコードされる49 kDaのタンパク質で、N末端にミトコンドリア局在シグナルがあり、ミトコンドリア膜間空間への移動が仲介されている (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2は膜間隙で37kDaの成熟型に加工され、N末端にIBMを遊離する(Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Table 1)。 リコンビナントOmi/HtrA2はin vitroでそれ自身の成熟を触媒することができるが、細胞内での成熟に関与するプロテアーゼはまだ不明である (Martins et al., 2002)。 Omi/HtrA2は、そのタンパク質分解活性を必要とするミトコンドリアの恒常性制御に必須の役割を担っているが、ミトコンドリアにおけるOmi/HtrA2の分子標的や相互作用パートナーはまだ定義されていない(Saelens et al.、2004)。 Omi/HtrA2がミトコンドリアから細胞質に放出されると、IAPsと拮抗することでカスパーゼ依存的に、またプロテアーゼとしてカスパーゼ非依存的に細胞死を促進する (Saelens et al., 2004)。 Smac/DIABLOと同様に、Omi/HtrA2はN末端のIAP結合モチーフを介してIAPをブロックし、三量体として提示される(Li et al, 2002)
シトクロムcの細胞質への放出は、シトクロムc/Apaf-1/カスパーゼ9を含むアポプトソーム複合体の形成を通じてカスパーゼ3の活性化を直接引き起こすが、Smac/DIABLOとOmi/HtrA2はIAPに対する阻害作用に拮抗しカスパーゼ活性化を間接的に促す(Saelensら, 2004)。 このように、アポトーシス促進分子とアポトーシス抑制分子の間には動的平衡が存在し、細胞は限られたミトコンドリア損傷に対処することができ、その場合、IAPは少量の放出シトクロムcによって始まるカスパーゼ活性化を十分に阻止することが可能である。 しかし、ミトコンドリア損傷が進行したり、同時に複数のミトコンドリアに影響を及ぼすような状況では、IAPが課す抗アポトーシスのハードルは、直接結合によってIAPを中和する拮抗薬のSmac/DIABLOやHtrA2/OMIの高い細胞質濃度によって克服できる
癌細胞にはIAPによって抑制されているアポトーシスへの内在性駆動があるという証拠が蓄積されている。 この目的のために、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-8活性の高い基底レベルおよびアポトーシスがない場合の活性カスパーゼ-3フラグメントが、正常細胞ではなく、様々な腫瘍細胞株および癌組織で検出された (Yang et al., 2003a). 正常細胞ではなく、腫瘍細胞がIAPを高レベルで発現していることから、腫瘍細胞では、発現が増加したIAPが選択的に基底の高いカスパーゼ活性を打ち消していることが示唆された(Yang et al.、2003a)。 したがって、IAPを標的とした戦略は、がん細胞において選択的に細胞傷害性治療の効果を高める有望なアプローチであると考えられている。 この目的のために、Smac/DIABLOのトランスフェクションによる強制発現は、異なる腫瘍におけるTRAIL誘導殺傷の閾値を下げ(Ng and Bonavida, 2002; Okano et al, 2003)、また化学療法に対して癌細胞を感作した(McNeish et al, 2003; Zhao et al, 2006)。 しかしながら、抗がん剤によるアポトーシスの際に内因性Smac/DIABLOが細胞質へ移動することは、例えばエトポシドで処理したヒト肺がん細胞のように、特定の条件下では主要な役割を果たすとは思われない(Bartlingら、2004年)。 IAP結合ペプチドSmac-N7はエトポシド誘導アポトーシスを促進したが、Smac/DIABLOの低分子化RNA(siRNA)はこれらの細胞におけるエトポシドによる死滅に影響を与えなかった(Bartlingら、2004年)。 これらのデータは、Smac/DIABLOの欠損は、ある種の癌細胞では冗長な決定因子の作用によって補われる可能性があることを示唆している。
Mitochondrial mediators of caspase-independent apoptosis
HtrA2/OMIはミトコンドリア膜間空間から放出されると、IAPsと拮抗してカスパーゼ依存的にアポトーシスを促進するだけではなく、プロテアーゼとしてカスパーゼ依存的にも細胞死を促進する (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002)。 In vitroのデータでは、HtrA2/OMIのプロテアーゼ活性によってXIAP、cIAP1、cIAP2、Apollonが分解されることが示されている(Suzuki et al.、2004)。 さらに、Trenciaら(2004)は、抗アポトーシス物質PED/PEA-15が細胞質HtrA2/OMIと相互作用し、それによって分解されることを証明した。 アンチセンスまたはRNA干渉によって細胞内のHtrA2/OMIのレベルを減少させると、スタウロスポリン、Fas、UVまたはシスプラチンによって誘導される細胞死に対する異なる癌細胞株の感受性が低下する(Martins et al, さらに、AIFとエンドヌクレアーゼGはミトコンドリア外膜の透過によりミトコンドリアから放出され、核内に移行して核クロマチンの凝縮と大規模なDNA断片化に寄与する(Candeら、2004;Saelensら、2004)。 この2つのタンパク質がシトクロムcの前に放出されるのか、一緒に放出されるのか、それとも後に放出されるのかについては議論がある (Arnoult et al., 2002)。 また、AIFは固有のDNase活性を持たないため、核DNAの断片化にどのように寄与しているのか、まだ正確には分かっていない。 哺乳類細胞では、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであるシクロフィリンAは、AIFと協力してDNAの破壊を誘導する(Cande et al.、2004)。
Disruption of the intrinsic pathway in cancer
ミトコンドリア経路の制御に関わる遺伝子における突然変異は、がん細胞では非常に一般的である。 抗がん剤治療の大半は、内在性経路をトリガーとしてがん細胞のアポトーシスを誘導するため、このような変異は通常、治療抵抗性と関連している。 例えば、免疫グロブリン重鎖遺伝子座へのbcl-2癌遺伝子の染色体転座の結果としてのBcl-2の過剰発現は、ヒト濾胞性リンパ腫の約85%と関連している(Tsujimotoら、1984)。 トランスジェニックマウスを用いた実験により、Bcl-2の過剰発現がBおよびTリンパ球および骨髄系細胞の腫瘍性転換を促進することが実証された(McDonnell and Korsmeyer, 1991; Traver et al, 1998)
抗アポトーシスBcl-2ファミリーメンバーの過剰発現が腫瘍形成を促進するという事実から、このファミリーのマルチBHドメインプロポトーシスメンバーは腫瘍抑制剤として機能するということがわかる。 しかし、BaxとBakはアポトーシスにおいて重複した役割を担っているため、この仮説が正しいかどうかを判断することは難しく、実際にbax-/-マウスは腫瘍形成に顕著な傾向はない(Knudsonら、2001年)。 しかし、bax遺伝子を不活性化する体細胞突然変異は、ある種の固形腫瘍や血液学的悪性腫瘍で見つかっている。 このため、ミスマッチ修復欠損(MMR)結腸癌や造血器悪性腫瘍においてBax遺伝子を不活性化する一塩基置換またはフレームシフト変異が記載されている(Rampinoら、1997;北田ら、2002)<3297><715>さらに、BH3のみのタンパク質が悪性転換の抑制に貢献し、善意の腫瘍抑制因子として機能できることを示している証拠が増えてきている。 例えば、Bimの単一対立遺伝子の欠損は、c-mycトランスジーンの発現によって誘導されるB細胞リンパ腫の発生を加速することが示され(Egleら、2004)、リンパ系の恒常性の調節因子としてのBimの重要な役割と一致する(Strasser、2005)。 興味深いことに、最近、マントル細胞リンパ腫の患者において、bim遺伝子を有する染色体領域のホモ接合性欠失が同定されている(Tagawa et al.) bidを欠くマウスは、慢性骨髄単球性白血病(CMML)に似た悪性腫瘍に進行し得る骨髄増殖性障害を自然に発症する(Zinkelら、2003年)。 さらに、プーマのRNAiによる抑制は、Mycによるリンパ腫の発生を加速させることが報告された(Hemann et al. 例えば、いくつかの抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質、例えばBcl-2、Bcl-XL、Mcl-1又はBfl-1の発現は、NF-κBによって転写的に制御される(Cory及びAdams、2002)<3297><715>Bcl-2ファミリータンパク質以外に、Apaf-1の活性の低下又は欠如は卵巣癌、メラノーマ及び白血病において見出された。 さらに、ヒトの癌で最も一般的な遺伝的欠陥である癌抑制遺伝子p53の変異は、内在性経路に影響を与える。 例えば、p53の活性化は、プロアポトーシスBH3のみのタンパク質であるPuma、Noxa、Bidなど、プロモーターに存在するp53応答要素を持つ多くの遺伝子をアップレギュレートする(Odaら、2000; Yuら、2001; Saxら、2002)。 その結果、p53が安定化した細胞は、ミトコンドリア細胞死経路の活性化に対して感受性が高くなる。 さらに、p53は、遺伝子の活性化を必要とせずに、ミトコンドリアの完全性に直接影響を与える可能性がある。 実際、p53はミトコンドリアにおいてBcl-2およびBcl-XLと結合し、ミトコンドリアの不安定化を促進することが報告されている(Mihara et al, 2003).
Signaling through the intrinsic pathway in cancer therapy
Most conventional chemotherapeutic agents, for example, etoposide, doxorubicin, cisplatin or paclitaxel, eligging permeabilization in the indirect fashion by trigger of intermediate metabolism or increasing the proapoptotic second messengers.The p53はミトコンドリアが不安定になることを誘導し、またミトコンドリアが活性化されることにより、ミトコンドリアが不安定になることを誘導する。 例えば、p53発現の誘導、セラミド/GD3経路の誘導、CD95/CD95Lリガンドシステムの誘導、Bcl-2様タンパク質への影響、および/またはレドックスやエネルギーバランスの悪化によるものである。
DNA損傷に伴う核・ミトコンドリア・クロストークが存在することを示す証拠は数多く存在する。 例えば、DNA損傷から生じるアポトーシス信号は、腫瘍抑制因子p53を介してミトコンドリアに伝達され、ミトコンドリアは次にアポトーゲン因子を細胞質内に放出して下流の破壊プログラムを活性化する(Mollら、2005)。p53は、例えばBid、PumaまたはNoxaなどのプロアポトーシスBcl-2タンパク質の発現を転写的に活性化してミトコンドリア経路に間接的に関与できる(Odaら、2000; Yuら、2001; Saxら、2002)。 さらに、p53は、プロアポトーシスBcl-2タンパク質BaxまたはBakの直接活性化を通じて、またはBcl-2またはBcl-XLなどのアンチアポトーシスBcl-2タンパク質の結合および不活性化を通じて、転写非依存的にミトコンドリア外膜の透過を直接引き起こすことができる(Mihara他、2003;Chipuk他、2004;Moll他、2005)。 さらに、カスパーゼ-2は、ミトコンドリア外膜を透過させることによって、および/またはミトコンドリア内膜とシトクロムcの会合を破ることによって、DNA損傷に応答してミトコンドリアアポトーシス経路に関与する能力を持っている(3297><715>)。 それゆえ、プロカスパーゼ-2アンチセンスを安定的にトランスフェクトした細胞、あるいは一過性にsiRNAを発現させた細胞は、DNA損傷によって誘導されるシトクロムc放出やカスパーゼ活性化、DNA断片化などの様々な下流イベントに不応である(Lassusら、2002; Robertsonら、2002)。 カスパーゼ-2は、例えば、プロアポトーシス蛋白質Bidを切断し、その後、ミトコンドリアに移動してチトクロムcの放出を誘導することによって、間接的にミトコンドリアに作用することができる(Guo et al.) さらに、カスパーゼ-2は、ミトコンドリア外膜を直接透過させ、シトクロムcおよびSmac/DIABLOの放出を刺激することができる。これはおそらく、処理されたカスパーゼ-2とミトコンドリア外膜、または外膜と内膜との接触部位にある推定タンパク質および/またはリン脂質との直接相互作用の結果である (Robertson et al.、2004).このように、マスキングされたミトコンドリアの外膜と、内膜の間のリン脂質との相互作用が、ミトコンドリア外膜を透過させ、シトコクロムcの放出を促す。 ミトコンドリア外膜の透過化は、カスパーゼ-2酵素のプロセシングを必要とするが、関連するタンパク質分解活性は必要とせず、Bax、BakおよびBcl-2を含むいくつかのBcl-2ファミリータンパク質とは独立して起こる(Robertsonら、2004年)。 さらに、カスパーゼ-2は、シトクロムcとアニオン性リン脂質、特にカルジオリピンとの間の結合を破壊する驚くべき能力を有することも示され、それによって、細胞質への放出に利用できるシトクロムcがさらに増える(Enoksson et al.、2004年)。 DNA損傷が起こると、カスパーゼ-2はいわゆるPIDDosomeで活性化されることが最近報告されている。PIDDはp53誘導性デスドメイン含有タンパク質であり、カスパーゼ-2とアダプタータンパク質RAIDDの複合体である (Tinel and Tschopp, 2004) 核・ミトコンドリアのアポトーシス経路があることが示唆された。
さらに、ヒストンH1.2は、DNA二本鎖切断後に核からミトコンドリアへのアポトーシスシグナルの伝達において重要な役割を果たすことが報告されている(Konishi et al, 2003). 核内ヒストンH1.2は、DNA二本鎖切断後にp53依存的な機構で細胞質へ放出され、Bak依存的に単離したミトコンドリアからのシトクロムc放出を誘導した(Konishiら、2003年)。 H1.2の発現を低下させると、X線照射やエトポシドによるアポトーシスに対する細胞抵抗性が向上する(Konishi et al. Nur77がBcl-2のBH4ドメインとBH3ドメインの間に位置するN末端ループ領域に結合すると、Bcl-2の構造変化が起こり、BH3ドメインが露出し、Bcl-2がプロテクターからキラーへと変化する(Lin et al.、2004年)。 興味深いことに、Nur77ファミリーのメンバーレベルの上昇は、患者における化学療法剤への好ましい反応と関連している(Shipp et al. BH3-onlyタンパク質の活性はいくつかのメカニズムによって抑制され、通常時にはマルチドメインのBcl-2対応タンパク質から遠ざけられ、ストレス条件下では急速に活性化される(Bouillet and Strasser, 2002)。 上記のように、Bid、PumaまたはNoxaのようなBcl-2ファミリータンパク質は、腫瘍抑制因子p53の転写制御下にあり、それゆえDNA損傷剤に応答して発現が上昇する(Odaら、2000; Yuら、2001; Saxら、2002)。 微小管に結合して細胞骨格に関連するBH3のみのタンパク質Bimは、微小管集合に作用するタキソールでの処理後に遊離し、内在性経路を活性化する(Suntersら、2003年)。 最近、パクリタキセルがin vitroおよびin vivoで上皮性腫瘍にBimの蓄積とBim依存性のアポトーシスを誘導することが証明された(Tanら、2005)。 活性型BH3-onlyタンパク質は抗アポトーシスに結合して対抗し、場合によってはマルチドメインのプロアポトーシスBcl-2ファミリーメンバーを活性化して、ミトコンドリア膜透過性の喪失につながる(Buillet and Strasser, 2002)。 Bcl-2タンパク質がどのようにミトコンドリア外膜の障害を引き起こすかはまだ議論の余地があり、いくつかのBcl-2ファミリータンパク質の孔形成能と自己凝集能、Bcl-2ファミリータンパク質によるミトコンドリア透過性転移孔の調節および/またはミトコンドリア膜内の脂質変化と脂質タンパク質相互作用が関与していると思われる。 さらに、パクリタキセルなどの化学療法剤は、Bcl-2の過リン酸化および不活性化を引き起こし、同時に、透過性転移(PT)孔の開口を促進する(Ruvolo et al, 化学療法薬はまた、ミトコンドリアメガチャネルがいくつかの酸化還元感受性部位を持っているため、活性酸素種の生成の促進(またはそれらの解毒の減少)、還元グルタチオンの枯渇、またはNADPHの枯渇による細胞酸化還元電位の変化を通じて、ミトコンドリア外膜の透過性を誘発または促進することができる(Debatinら、2002年)。 さらに、エネルギー代謝の変化、例えばADPやATPの枯渇は、透過性遷移孔複合体(PTPC)の開口を促進するかもしれない。ADPやATPはアデニンヌクレオチド輸送体の生理的リガンドであり、PTPCの内因性阻害剤として機能するからだ(Costantini et al, 2000)。 また、呼吸鎖の結合解除や阻害、マトリックスのアルカリ化は、ミトコンドリア膜の透過を促進する可能性がある。 さらに、細胞障害性薬剤を含むいくつかのアポトーシス誘導刺激にさらされた細胞で生成されるセラミドのような脂質メッセンジャーは、ミトコンドリア膜の透過化に寄与しうる(Susinら、1997年)。 高濃度では、いくつかの化学療法薬、例えば、エトポシドまたはパクリタキセルは、単離されたミトコンドリアにおいてミトコンドリア外膜の透過化を誘発することもできる(Robertsonら、2000;Kiddら、2000。 2002)。
さらに、亜砒酸、ロニダミド、合成レチノイドCD437または天然物ベツリン酸などの実験的抗癌剤が、ミトコンドリアに直接作用することが示されている(Debatinら、2002)。 例えば、ベツリン酸は、カスパーゼ阻害剤Z-VAD-fmkの影響を受けず、なおかつPTPCの阻害剤であるBA、またはBcl-2およびBcl-XLによって抑制される方法で単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア膜電位の損失を直接誘導してアポトーシスを誘発すると報告されている(Fullda et al, Bcl-2 family proteins
内因性アポトーシス経路を強力にブロックする抗アポトーシスBcl-2タンパク質は、血液および非血液由来のヒト癌において高いレベルで見出されるので(Cotter、2004)、それらは治療介入のための有望な標的であることを示す。 その結果、Bcl-2タンパク質を標的とするいくつかの戦略が開発されてきた。例えば、アンチセンス技術、BH3-ドメインペプチド、あるいはBcl-2様タンパク質機能を阻害する合成低分子薬物などである。 Bcl-2の発現をダウンレギュレートするために、Bcl-2アンチセンスオリゴヌクレオチド(genasense)がGenta Incorporated(Berkeley Heights, NJ, USA)により開発された。 ジェナセンスは、Bcl-2タンパク質をコードするmRNAオープンリーディングフレームの最初の6つのコドン(すなわち、18塩基)を選択的に標的とする合成、18塩基、一本鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである(Cotter、2004)。 ジェナーセンスによる治療は、多くの化学療法剤、例えば、タキサン、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金含有剤の抗腫瘍活性を顕著に増強した(Cotter, 2004)。 メラノーマの前臨床モデルにおいて、ジェナセンスによる前処理は、ヒトメラノーマの化学感受性を増加させた(Jansenら、1998年)。 また、臨床試験において、ジェナセンスは悪性黒色腫患者のダカルバジンの化学増感剤として作用することが報告されています(Jansenら、2000年)。 アンチセンスに基づく治療を最適化するために、Bcl-2とBcl-xLでは相同性が高いが、Bcl-xS mRNAでは欠損している配列に対する二重特異的アンチセンスオリゴがその後設計された(Zangemeister-Wittke et al.、2000)。 Bcl-2とBcl-xLの両方を同時にダウンレギュレートすることにより、様々な癌細胞においてアポトーシスを誘導し、化学感受性を高めた(Gautschiら、2001; Tortoraら、2003; Milellaら、2004; Yamanakaら、2005)。
さらに、BH3ドメインのペプチドまたは合成低分子阻害剤が、抗アポトーシスBcl-2様タンパク質を標的として開発された。 BH3ドメインは、Bcl-2様タンパク質の疎水性ポケットに結合する9アミノ酸の両親媒性α-ヘリックスからなる(CoryとAdams、2002年)。 同様に、BH3ドメインペプチドは、この複合体を破壊し、それによって癌細胞をアポトーシスに敏感にさせることを目的としている(Letaiら、2002年)。 さらに、Bid BH3ドメインを炭化水素ステープリングによって相互作用領域とは反対側の表面に非天然アミノ酸で置換すると、SAHBs (stabilized α-helix of Bcl-2 domains) と呼ばれる安定化BH3ペプチドとなり、薬理特性が改善した (Walensky et al., 2004)。 これらの安定化BH3ペプチドは、様々な白血病細胞株においてアポトーシスを誘発し、また、副作用なしにマウスにおける白血病異種移植片の成長を阻害した(Walenskyら、2004年)。 Bcl-2タンパク質のBH3ポケットに結合できる化合物の化学ライブラリーをスクリーニングした結果、Bcl-2への結合をBakと競合する化合物であるHA14-1を同定した(Wang et al.、2000年)。 Degterevら(2003)は、蛍光偏光アッセイでBcl-xLから蛍光Bak BH3ペプチドを置換する能力について16 320の事前選択された化合物のライブラリをスクリーニングすることによって、BH3阻害剤(BH3I)と呼ばれる2種類の薬剤クラスを同定した。
Smac/DIABLO アゴニスト
XIAP を標的とする治療可能な低分子を設計するためには、ミトコンドリアからの放出後 Smac/DIABLO に結合する XIAP の BIR3 ドメインの結合溝に最も注目が集まっている。 構造解析は、XIAP BIR3からのSmac/DIABLOのカスパーゼ9置換活性を模倣できる低分子化合物の合成に明確な根拠を与えている(Chaiら、2000年;Wuら、2000年)。 細胞内送達を強化するために、Smacペプチドを、例えば、HIV Tatタンパク質のタンパク質伝達モチーフ(Fuldaら、2002)、Drosophila antennapaedia penetratin配列(Arntら、2002)またはポリアルギニンストレッチ(Yangら、2003b)などのキャリアに連結させた。 XIAPとの結合に必須な成熟Smac/DIABLOのN末端を表すヘプタペプチドは、カスパーゼ活性化を促進し、様々な腫瘍細胞株、また死受容体ライゲーションまたは細胞毒性薬によって誘導されるアポトーシスに対して原発患者由来の腫瘍細胞を感作することが報告された(Fuldaら、2002年)。 重要なことは、Smacペプチドは、頭蓋内悪性神経膠腫異種移植モデルにおいて、in vivoでTRAILの抗腫瘍活性を増強さえしたことである(Fuldaら、2002b)。 同様に、Drosophila antennapaedia penetratinのタンパク質伝達ドメインと融合した8merペプチド(AVPIAQKS)は、乳癌細胞に入り、XIAPおよびcIAP1と結合し、paclitaxel、etoposide、7-ethyl-10-hydroxycamptothecin(SN-38)およびdoxorubicinなどの多くの抗癌剤によって誘発されるカスパーゼ活性を増強できた(Arnt et al, 2002)。 さらに、Smac/DIABLOとXIAP BIR3の複合体の立体構造に基づいて、Smacペプチドミメティクスが設計され、TRAIL、TNFα、シスプラチンまたはエトポシドと協力して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発した (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005)。
その後、ファージライブラリーやポリフェニルウレアライブラリーのスクリーニングによって得られたXIAPの非ペプチド性低分子アンタゴニストが、IAPをターゲットとして開発された(Schimmer et al, 2004; Wang et al, 2004)。 また、最近、伝統的な生薬の立体構造データベースの構造に基づく計算機的スクリーニングにより、日本のアルディシアハーブからの天然物エンベリンが、細胞透過性、非ペプチド性、低分子量のXIAP阻害剤として発見された(Nikolovska-Coleskaら、2004年)。 エンベリンは、XIAPのBIR3ドメインに結合することにより、XIAPの内因性レベルが高い前立腺癌細胞やXIAPをトランスフェクトしたJurkat細胞において、XIAPの保護効果を効果的に克服することが示された(Nikolovska-Coleskaら, 2004)。 このように、Smacアゴニストや低分子XIAPアンタゴニストは、がん細胞において選択的に細胞毒性療法の効果を増強することにより、がん治療の有望な候補となる可能性があります<3297>。