Small Dense Low-Density Lipoprotein as Biomarker for Atherosclerotic Diseases

Abstract

低密度リポタンパク質（LDL）は動脈硬化や心血管疾患の発症と進行に重要な役割を担っている． LDLは大きさと密度が異なるいくつかのサブクラスの粒子からなり，大型浮遊性（lb）LDLと中・小型高密度（sd）LDLが含まれる。 sdLDLは他のLDLサブクラスよりも動脈硬化の進行が速いこと、またsdLDLコレステロール（sdLDL-C）の割合が総LDL-Cよりも心血管疾患の予測マーカーとして優れていることはよく知られているところである。 sdLDLは血漿中で脱シアリル化、糖化、酸化など様々な修飾を受けやすく、その結果、動脈硬化の進行が促進される。 このような修飾を受けたsdLDLは、心血管疾患に関連する炎症過程を引き起こす可能性があります。 LDLサブクラスの分離にはいくつかの方法が開発されているが、ほとんどの場合、異なる方法によって得られた結果を直接比較することはできない。 近年、均質な分析法の開発により、LDLサブクラスの分析が容易になり、心血管疾患の発症におけるsdLDLの重要性を評価する大規模な臨床試験が可能になった。 今後，臨床におけるsdLDLの評価と補正のガイドラインを確立するために，さらなる研究が必要である

1. はじめに

動脈硬化とそれに伴う心血管系疾患（CVD）の発症率は高く、その原因や危険因子の研究は急務である。 動脈硬化性プラークの成長は、循環コレステロールの内皮下細胞への取り込みに依存している。 高コレステロール血症は、動脈硬化のよく知られた危険因子の一つであり、コレステロール低下療法は、CVDの治療のために臨床で広く使用されている 。 しかし、ほとんどの臨床試験で達成されたCVDリスクの減少は30％以下であり、他の重要なリスク要因を考慮する必要があることを示している。 動脈硬化の発症と進行は、循環リポ蛋白の量だけでなく、その特異的な性質に依存することを示す強力な証拠がある。

循環リポ蛋白粒子は、サイズ、密度、脂質およびアポリポ蛋白の組成が異なり、物理・化学パラメータに基づいていくつかのクラスに分類することができる。 低密度リポタンパク質（LDL）は動脈硬化性脂質の主な貯蔵源であるが、高密度リポタンパク質（HDL）は動脈硬化性ではなく、そのレベルは動脈硬化性CVDリスクと逆相関する。 Small dense LDL (sdLDL) は動脈硬化患者の血清中に特に多く存在し、その化学修飾により粥状硬化性が増加しやすい。 血漿LDLプロファイルの分析は、LDL粒子をその密度またはサイズに基づいて分離することができる超遠心分離または勾配ゲル電気泳動によって行うことができます。 LDL粒子のサイズ、電荷、化学的性質を評価するために他の方法が使用されており、このレビューで後述する。 現在、日常臨床で使用できる安価で信頼性の高いLDLプロファイリング法の開発は、依然として困難な目標である

循環LDL粒子の組成と動脈硬化およびCVD発症のリスクとの関連を確立するために、数多くの臨床研究が行われてきた。 現在のコンセンサスによれば、血漿LDLプロファイルに基づいて2つの主要な表現型、AとBが定義され、その中間のA/B表現型が横たわっている 。 表現型Aはlarge buoyant LDL (lbLDL)が優勢で、表現型BはsdLDLが優勢であることが特徴である 。 表現型Bは、代謝異常、肥満、2型糖尿病など多くの疾患で報告されており、冠動脈疾患（CHD）の危険因子と考えられている。 さらに、この表現型は、血漿トリグリセリド（TG）値の上昇、HDLコレステロール（HDL-C）の低下、高い肝リパーゼ活性と関連していた。 現在、全米コレステロール教育プログラム（NCEPIII）では、sdLDLの優位性がCVDの危険因子として受け入れられている。 LDL粒子は、密度や大きさとは別に、血液中で様々な変化を遂げるため、化学組成も様々である。 その中でも、アポリポ蛋白Bと共有結合したリポ蛋白分子を含むリポ蛋白（a）（Lp（a））は、さらなる心血管危険因子として特徴づけられている。 Lp(a)は、アポリポ蛋白Bと共有結合したリポ蛋白で、血中の含有量は少ないが、動脈硬化の進展の指標となるため、修飾LDL粒子の検出と測定は特に興味深い。

2 LDLサブクラスとその同定法

LDLとは広く、密度 1.006 ～ 1.063 g/mlの範囲で、様々な検査方法により分離できるリポ蛋白画素と定義されています。 この範囲には、中間密度リポ蛋白（IDL）および超低密度リポ蛋白（VLDL）も含まれる。 より正確には、LDLは1.019〜1.063 g/mlの密度を有することが知られている。 LDLの分析には、超遠心分離法やグラジエントゲル電気泳動法（GGE）およびその改良法が広く用いられている。 これらの方法を用いた研究の多くでは、LDL粒子は、large (LDL I), intermediate (LDL II), small (LDL III), そしていくつかの研究ではvery small (LDL IV) LDLを含む3または4のサブクラスに分類される。 LDL IIIとLDL IV（識別可能な場合）はsdLDLと呼ばれる。

歴史的に、異なるLDL分画の分離を可能にした最初の方法は分析的超遠心分離法であった。 この方法では、LDL粒子はその浮遊率（Sf）に基づいて分離される。 3つのLDLサブクラスが定義されている研究では、LDL I、II、IIIの密度はそれぞれ1.025-1.034 g/ml, 1.034-1.044 g/ml, 1.044-1.060 g/mlであった。 いくつかの研究では、非常に小さなLDL IV粒子が分離されています。 表現型パターンAはLDL IとIIが優勢であること、粥腫表現型パターンBはLDL IIIとIVが優勢（>50％）であることが特徴である。 超遠心分離の方法が異なると、分離されたLDLの密度にわずかな違いが生じる。 例えば、iodixanol gradientは従来のsalt gradientよりもLDL粒子の密度が低くなるが、これは粒子が本来の水和状態を維持するためである

LDLサブフラクションの分析でもう一つ広く用いられている方法はnondenaturating conditionsでのGGEである。 この方法では、LDLサブクラスは、リポタンパク質のサイズと形状によって決定される電気泳動移動度によって分離される . LDLのGGE分離を用いた研究では、4つのサブクラスが定義されています。 LDL I (large LDL, peak diameter 26.0-28.5 nm), LDL II (intermediate LDL, 25.5-26.4 nm), LDL III A and B (small LDL, 24.2-25.5 nm), および LDL IV A and B (very small LDL, 22.0-24.1 nm) 。 LDL粒子径のピーク値によって2つの表現型が区別される。 表現型パターンA（大型および中間型LDL）は>25.5 nm、表現型パターンB（小型および超小型LDL）は≦25.5 nmである。 超遠心法とGGEで分析したLDL粒子のサイズと密度にはそれぞれ強い相関がありますが、これらのパラメータは同一ではありません。 また、LDLサブフラクションの解析にチューブゲル電気泳動法を用いると、迅速に定量的な結果を得ることができる。

核磁気共鳴法（NMR）は、LDLサブクラスを含む血漿中のリポ蛋白クラスの研究に用いることが可能である。 しかし、NMRによる粒子径測定の結果は、同じ患者のGGEデータとは大きく異なり、直接比較することはできない。sdLDLはNMRによって18.0～20.5 nmの粒子として決定される。

その他のLDL画分分析法としては、ゲルろ過塔を用いた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 、動的光散乱、イオンモビリティ分析およびホモジナスアッセイ分析が挙げられる。 後者は再現性が高く、大規模臨床試験に適しているため、特に注目されている。 sdLDL-コレステロールのホモジニアスアッセイ法は、Hiranoらによって最初に報告された。 それ以来、このアッセイは、分析手順を簡略化するために改良されてきた。 本法は、sdLDL（粒子径 15.0-20.0 nm）を洗浄剤およびスフィンゴミエリナーゼ処理により lbLDL と分離し、sdLDL-コレステロール濃度を測定するものです。 本法は、標準的な臨床検査装置を用いて、密度1.044～1.063g/mlのsdLDL画分を分離する。 LDLサブクラス分析で最も広く用いられているいくつかの方法の比較を表1に示す。

LDLサブクラスの臨床的・診断的意義が明らかになるにつれて、標準化の問題がクローズアップされてくる。 LDLサブクラス解析の方法が異なれば結果も異なり、1つの方法であっても大きなばらつきが生じる可能性がある。 どの方法が最も正確で、同時に臨床に適していると推奨できるのか、現状では判断が難しい。 さらに、LDLサブフラクション解析法のCVDアウトカム予測に関する比較データは、現時点では得られていない。 LDLサブクラスの起源

LDLサブクラスの正確な起源は、まだ解明されていない。 Berneisらは、肝トリグリセリド（TG）の利用可能性に依存する2つの経路の存在を提唱している。 肝臓からは2種類の前駆体リポ蛋白（Lp）が分泌され、TGに富むアポリポ蛋白B（apoB）とTGに乏しいアポリポ蛋白B（apoB）が含まれている。 TGが少ないときは、VLDL1（TGに富んだLp）とIDL2（TGに乏しいLp）が分泌されます。 TGの利用可能性が高い場合、より大きな粒子、例えば、より大きなVLDL1（TG-rich Lp）およびVLDL2（TG-poor Lp）が分泌される。 TG-poor Lpはより大きなLDLサブクラス（LDL IおよびLDL II）の前駆体であり、TG-rich Lpはリポ蛋白リパーゼ（LPL）および肝リパーゼ（HL）による脱脂を経てsdLDLサブクラス（LDL IIIおよびLDL IV）へと変換される。 コレステロールエステル転移タンパク質（CETP）は、TGをsdLDL粒子に転移し、さらにHLによって脱脂され、より小さい粒子が生成される（図1）。 この説は、肝臓から分泌される前駆体とは異なるsdLDLの代謝経路を提唱しており、LDL IとLDL III、LDL IIとLDL IVの間に逆相関があることを示したあるヒト介入研究の結果からも支持されている … 段階的な修飾の結果として、sdLDL粒子は化学的含有量が変化し、リン脂質（アポリポタンパク質B含有量に基づいて測定）、遊離コレステロールおよびコレステロールエステルの量が減少し、TG含有量は変化していない。

最近の研究では、少なくとも代謝異常の患者ではsdLDLには複数の起源があることが示唆されている。 家族性高コレステロール血症患者におけるアフェレーシス後0～7日目のLDLサブフラクション解析の結果、sdLDLのリバウンド動態は、直接経路とlbLDLの脱脂を組み合わせたモデルで最もよく説明できることが実証された 。 sdLDL産生の調節は、現在の代謝状態に依存していると思われる。 アポB代謝におけるアポEとアポC-IIIリポ蛋白の制御的役割については、健常者と高トリグリセリド血症患者を対象とした最近の研究で明らかにされた。 血漿中TG濃度が正常な場合、肝臓は主にアポEを含むTGリッチなVLDLを分泌し、それは循環から速やかに除去された。 しかし、高トリグリセリド血症では、循環時間が長く、sdLDLに変換されるTGに富むアポC-III含有リポ蛋白にバランスがシフトしていることがわかった。 apoE含有リポ蛋白のクリアランスも減少した。 その結果、sdLDLの形成率が高く、クリアランスが低下しているため、sdLDL値が上昇する表現型パターンBが出現した。 これらの結果から、CVDリスク低減のためには、高トリグリセリド血症をコントロールすることが重要であることが明らかになった。 生活習慣や食事の変化がTGおよびsdLDL産生に及ぼす影響を評価するために、数多くの研究が行われており、他の文献でもレビューされている。 オメガ3多価不飽和脂肪酸のようないくつかの食事成分は有益な効果を持つことが実証された。

LDL粒子は、LDLとVLDLおよび/またはHDLとHL間のTGとコレステロールエステルの交換を行うCETPによって修飾される可能性がある。 これは、より小さなsdLDL粒子の産生につながる。 そのため、CETPを阻害すると、HDL-Cが低い人や健康な閉経前女性ではsdLDL画分が減少する可能性がある。

sdLDL産生に影響を及ぼす遺伝的要因については、最近行われたゲノムワイド関連研究（GWAS）で検討されている。 VLDLの肝臓での放出に関与する選別受容体sortilinのプロモーター領域の一塩基多型（SNP）が、肝臓でのsortilin合成に変化をもたらし、リポタンパク質プロファイルに影響を与えることが明らかにされた。 Very small LDL fractionは、マイナーアレルホモ接合体に比べ、メジャーアレルホモ接合体では20％増加した 。 リポ蛋白代謝の変化に関連するSNPは、CETP、LPL、LIPC、GALNT2、MLXIPL、APOA1/A5、PCSK7など、様々な遺伝子座で報告されている。 そのため、sdLDLの代謝は遺伝的要因に依存し、新たな治療法の開発につながる可能性がある。

4 sdLDLのアテローム性修飾

sdLDLの循環時間は、LDL受容体と反応して血中から排除される大粒LDLに比べ長いため、LDL受容体を介することができない。 動脈硬化プラークの形成には、動脈壁に存在する泡沫細胞による脂質の捕捉と蓄積が重要である。 LDL粒子はプラークに蓄積されるコレステロールの主な供給源であり、そのアテローム性特性は広く研究されている。 LDLは培養細胞に脂質を蓄積させないが、酸化LDL、脱シアリル化LDL、糖化LDL、電気陰性LDLなどの修飾LDLは高いアテローム性を示すことが明らかにされた。

血漿中の酸化は、最初に提唱されたLDL粒子の粥腫性修飾の一つです。 酸化は、LDL粒子上に酸化特異的なエピトープを生成し、免疫反応と炎症を誘発します。 酸化LDLは、CD36やTLR-4を含む多くの受容体によって認識される。 sdLDL の酸化に対する感受性が高いことは、その脂質組成によって説明できる 。 さらに、sdLDL粒子は抗酸化ビタミンをあまり含まないため、より大きな形態のリポタンパク質よりも酸化されやすい。

LDL粒子におけるリポタンパク質関連ホスホリパーゼA2（Lp-PLA2）の濃縮は、心血管疾患と関連していることが知られています。 PLA2は電気陰性LDLや進行した動脈硬化プラークで高濃度に存在することが報告されている。 この酵素はリポ蛋白粒子の内部で、酸化されたリン脂質を切断し、炎症性物質を放出し、さらに粥状硬化を促進する。 トランスシアリダーゼはLDL粒子からシアル酸部分を血漿タンパク質、中性スフィンゴ脂質、ガングリオシドなど様々なアクセプターに転移させる。 精製LDLを血漿と数時間インキュベートすると、粒子の脱シアリル化が徐々に進行することが示された。表現型パターンBの被験者では、sdLDLはlbLDLに比べてシアル酸含量が減少している。 脱シアリル化により、sdLDL粒子は動脈壁のプロテオグリカンへの親和性が高くなるらしい。 その結果、脱シアル化sdLDLは内皮下空間での滞留時間が長くなり、脂質の蓄積や動脈硬化のプラーク形成に寄与することになる。

ApoB リポタンパク質は、in vitro および in vivo の両方で lbLDL よりも sdLDL 粒子で優先的に糖化されることが示され、糖化された apoB のレベルは NMR で測定した粒子径と逆相関する。

動脈硬化患者の血漿中の電気陰性 LDL (LDL-) レベル上昇の起源は完全に分かってはいないが、LDL(-) は、電気陰性 LDL よりも高い。 いくつかのメカニズムが提案されており、酸化、タンパク質成分の修飾、プロテオグリカンへの結合などがある 。 LDL(-)とsdLDLの関係については、いくつかの研究がなされている。 健常者の血漿中のLDL(-)は濃厚サブフラクションに多く含まれ、高コレステロール血症患者のLDL(-)はほとんどが軽質LDLフラクションに含まれることが明らかになった . 冠動脈疾患リスクの高い患者の血漿中ではLDL(-)が増加していた . 別の研究では、LDL(-)は高濃度LDL画分と軽度LDL画分の両方に存在する二峰性の分布であった . しかし、LDL(-)産生の増加は、酸化LDLとsdLDLレベルの増加と密接な関係があることが示された。

ヒト血漿中の自然発生変性LDL形態を検出するための取り組みが行われた。 Lp(a) のレベル上昇は、その目的のために開発され最適化されたイムノアッセイによって選択的に検出することができた。 酸化LDLは容易に単離できないが、他のタイプの修飾LDL、例えば脱シアリル化LDLやLDL（-）は精製されている。 前者はレクチン吸着法を用いて、後者はイオン交換クロマトグラフィーやキャピラリーアイソタコフォレーシスなど、粒子の電荷に敏感な方法を用いて血清中の分析が可能であった。 単離LDL(-)粒子のシアル酸含量は、ネイティブLDLと比較して、健常者では1.7倍、動脈硬化患者では3倍低いことがわかった。 一方、脱シアリル化LDLはLDL(-)に濃縮されていた。 これらのことから、脱シアル化LDLと電気陰性LDLは類似あるいは同一のサブフラクションである可能性が示唆される（表2）。 さらに、脱シアル化LDLとLDL(-)はともに酸化されやすく、抗酸化ビタミンの含有量はネイティブLDLより少ない。 したがって、LDLは血流中では、脱シアリル化と負電荷の獲得に始まり、酸化と高度にアテローム性で炎症性の複合体の形成という複数の修飾を受けると考えるのが妥当であろう。

5. sdLDLと動脈硬化性CVDリスク

sdLDLの動脈硬化性の増大は、この粒子の特異的な生化学的および生物物理学的性質に関連している。 sdLDLは粒子が小さいため、動脈壁に入りやすく、コレステロールの供給源となり、脂質を蓄積する。 循環時間が長いと、血漿中のsdLDLが粥状に変化する可能性が高くなる。 sdLDLが動脈硬化やその他の疾病の発症に果たす役割については、数多くの研究が行われてきました。 最近の研究では、sdLDL-C濃度は総LDL-Cよりも冠動脈心疾患（CHD）の評価のための優れたマーカーであることが示された 。 別の研究では、sdLDL-C濃度の上昇は、総sdLDL粒子濃度ではなく、非糖尿病患者におけるCHDリスクの有意なマーカーであることが明らかにされた。 この研究では、多数の患者を対象に、sdLDL粒子分画をNMRで測定し、sdLDL-Cを自動分析装置で分析した。 2型糖尿病および糖尿病予備軍を対象とした小規模の前向き研究では、sdLDL割合（GGEによる測定）が内膜中膜厚（IMT）の増加およびインスリン抵抗性の予測因子であることが示された。 sdLDL値の上昇は、CA-IMTとともに、従来のCVDの危険因子と関連している。 Shenらは、CA-IMTを用いたCVDリスク評価において、高年齢、男性、喫煙、CVDの家族歴などの従来のCVDリスクファクターを調整しても、SdLDL-Cは他の標準パラメーターよりも優れた脂質変数であることを示唆した 。 最後に、sdLDL-CとCHDの関連は、sdLDL評価のためのホモジニアスアッセイを用いて11,419人を対象に行われた大規模な前向き研究で明確に示された。 sdLDL-Cは、LDL-C値に基づいて心血管リスクが低いと考えられる患者でもCHDリスクを予測し、CVDリスク評価のための付加価値を提供している。 バルーン血管形成術後の早期転帰（歩行距離の改善、再狭窄なし）が悪い患者において、sdLDL値の上昇が登録された。

脂質異常症、糖尿病、メタボリックシンドローム（MetS）など、動脈硬化に関連する多くの疾患で、sdLDLの上昇も報告されている。 MetSでは、sdLDL値の上昇は、将来の心血管イベントの独立した予測値であった 。 特に、sdLDL-C/LDL-C比はMetSに関連する様々なパラメータと良好な相関を示し、sdLDL-CやLDL-Cの絶対値よりも有用な臨床指標であることが示唆された … 興味深いことに、sdLDL分画は慢性腎臓病（CKD）で有意に増加しており、その測定はCKD患者におけるCVDリスク評価に利用できる可能性がある。 sdLDLに対するスタチンや他の治療薬の効果

動脈硬化とCVD発症におけるsdLDLの重要性を示す証拠が蓄積されたため、多くの研究は脂質プロファイル改善に焦点を当てたものであった。 sdLDLの優位性は、TG値の上昇とHDL値の低下と関連している。 したがって、sdLDL-Cの比率を下げたり、HDL-Cの含有量を増やしたりすることが治療目標になります。 スタチンは、動脈硬化およびその関連疾患の脂質異常症の治療のための脂質低下剤として、臨床で広く使用されています。 しかし、スタチンがsdLDL-Cの特異的な低下に対して有効であるかどうかは、多くの情報が得られているにもかかわらず、まだ明らかではありません。 その点では、臨床試験の結果は時に矛盾している 。 いくつかの研究では、スタチンがsdLDLの割合を減少させることができなかった。なぜなら、より大きなLDL分画も減少し、sdLDL-CとlbLDL-Cの比率は変わらなかったからである . したがって、スタチン治療の成果は、sdLDL濃度の絶対的な変化で評価すべきであり、その相対的な含有量やサイズ分布で評価すべきではありません。 LDL分画法の標準化の欠如と臨床的特徴の多様性が、臨床試験結果の客観的な比較を妨げている。 スタチン治療のsdLDL-C割合への効果やCVDリスク低減との関係について結論を出すには、より多くの介入研究が必要である。

スタチン以外にも、エゼチミブやフィブラートなどの高脂血症薬にはLDLサブフラクションの有益性があった . エゼチミブは大・中LDLを減少させ、sdLDL粒子はそれほどでもなかった 。 フィブラートとナイアシンはsdLDLを減少させ、LDL粒子径の分布をlbLDL側にシフトさせた。 ゲムフィブロジルは、特に表現型パターンBの被験者でsdLDL分画を低下させた。 フェノフィブラートは、スタチンよりも効率的にTGとHDL-C値を改善し、フェノフィブラートとスタチンの併用療法は、いずれかの薬剤の単剤療法よりも強力に脂質プロファイルを改善することが確認された。 2型糖尿病患者を対象としたパイロット試験では、フェノフィブラートのCHDリスク低減効果を証明することはできなかったが、網膜症など多くの血管系アウトカムに対する有益な効果が示された. 肥満の患者では、sdLDL値はオルリスタットなどの抗肥満薬やカロリー制限、ライフスタイルの変更によって改善することができる。 結論

最近の研究結果は、LDL分画には異なるアテローム性があり、sdLDLは大きなLDLサブ分画よりもアテローム性があることを示している。 sdLDLは動脈壁への浸透性が高く、動脈硬化性プラーク形成のための強力なコレステロール源となることが特徴である。 重要なことは、sdLDLの循環時間が長くなると、血漿中のsdLDL粒子に複数の粥腫性修飾が生じ、粥腫性がさらに高まるということである。 動脈硬化およびCVDの発症におけるsdLDLの役割の研究は、異なる方法によって得られたLDL分画の結果の大きなばらつきによって妨げられています。 そのため、安価で迅速、かつ信頼性の高いLDL分画の定量分析法の開発が求められており、同種の分析法が開発されて以来、その方向で大きな進展があった。 スタチンをはじめとする脂質低下剤は、LDLプロファイルの補正に有効であることが報告されているが、CVD予防・治療におけるsdLDL低下について明確なガイドラインを描くためには、より多くの研究が必要である。 CVDリスク管理におけるsdLDL低下の有効性については多くの疑問が残されているが、脂質異常症を伴う多くの疾患において、sdLDL-C比率がCVD予測の重要なマーカーであることを示すエビデンスが蓄積されてきている。

利益相反

著者は利益相反を宣言しない

謝辞

この研究はロシア基礎研究財団（グラント＃15-04-09279）により支援された

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著者はロシア基礎研究財団により支援された…

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