La función digestiva principal de la bilis es ayudar a la dispersión y digestión de la grasa en el lumen del intestino delgado. La bilis se forma inicialmente en el hepatocito (célula del hígado), y la velocidad de formación depende principalmente de la velocidad de secreción de los ácidos biliares en los canales biliares, o canalículos. Sin embargo, una parte del flujo biliar está relacionada con otros factores distintos a la secreción de ácidos biliares; en concreto, parece depender de la secreción de sodio del hepatocito y también se rige parcialmente por la acción de hormonas intestinales como la secretina, la colecistoquinina (CCK) y la gastrina. La reserva total de ácidos biliares en un momento dado es de unos 3 gramos (aproximadamente 0,1 onzas), y casi toda ella está contenida en reposo en la vesícula biliar. En su paso por el tracto biliar, la bilis hepática se concentra hasta una décima parte de su volumen original mediante la reabsorción selectiva de agua, cloruro y bicarbonato. Este proceso de concentración tiene lugar en gran medida en la vesícula biliar y, como resultado, la bilis de este órgano es mucho más densa y de color más oscuro (debido a la concentración de pigmentos) que la bilis que sale del hígado. La distensión del duodeno, especialmente por una comida que contenga grasa, provoca la secreción de CCK, una hormona que provoca contracciones de la capa muscular de la pared de la vesícula biliar.
Además de iones inorgánicos (sodio, potasio, calcio, magnesio, cloruro y bicarbonato), la bilis contiene proteínas y bilirrubina; esta última es la responsable de su color dorado en soluciones diluidas y del color ámbar oscuro en concentradas. Sin embargo, es más rica en ácidos biliares (derivados del colesterol en el hepatocito), fosfolípidos (en gran parte fosfatidilcolina o lecitina) y colesterol. El colesterol es un esterol de cuatro anillos que se absorbe de la dieta o es sintetizado por el hígado y el revestimiento intestinal. Normalmente no es soluble en las secreciones acuosas, el colesterol es transportado en una solución coloidal en la bilis en forma de agregados mixtos de complejos que contienen ácidos biliares y lecitina. En ausencia de cantidades adecuadas de lecitina y ácidos biliares, el colesterol se cristaliza. El hígado sintetiza dos tipos de ácidos biliares primarios a partir del colesterol, llamados ácido quenodesoxicólico y ácido cólico. En el intestino inferior, la acción bacteriana elimina uno de los grupos hidroxilos (deshidroxilación) del ácido cólico, transformándolo en ácido desoxicólico. Este ácido biliar secundario aparece en la bilis porque es absorbido desde el intestino y recirculado al hígado. El ácido quenodesoxicólico también se deshidroxila en el intestino, convirtiéndose en ácido litocólico, una pequeña cantidad del cual también se reabsorbe y aparece en la bilis normal.