Resultados y discusión
El ensayo de ‘flujo autofágico’ descrito en Jiang et al. es un ensayo reportero cuantitativo de proteína verde fluorescente (GFP) que mide los cambios ratiométricos de polyQ-GFP a GFP libre a través del análisis Western blot. Se diseñó una construcción reportera multicistrónica para codificar dos proteínas: poliQ unida a GFP N-terminal y GFP libre. La secuencia viral 2A (v2A) se colocó como región de enlace entre las secuencias que codifican las dos proteínas para permitir la traducción estequiométrica de dos proteínas separadas a partir de un marco de lectura abierto (Fig. 1a).
Generación de los constructos putativos Q52, Q31 y Q10-GFP utilizando el constructo reportero multicistrónico Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. a Mapa vectorial del constructo Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. b Resumen del uso de codones degenerados CAA y CAG en este constructo. c Cromatografía del constructo que muestra los tripletes CAG y CAA codificantes de glutamina intercalados al azar. d Ilustración esquemática de la amplificación por exclusión basada en PCR del constructo que contiene Q80-GFP para generar constructos polyQ con menor número de repeticiones de glutamina. e Secuencia de Q80 que muestra los sitios de unión de los cebadores Q52, Q31 y Q10. f Secuencias de los cebadores destinados a generar las construcciones Q52, Q31 y Q10. g Electroforesis analítica en gel de agarosa para cada uno de los vectores putativos Q80, Q52, Q31 y Q10 utilizando cebadores que flanquean la región polyQ. Se observaron tamaños de productos PCR de ~ 270, ~ 180, ~ 120 y ~ 60 pb para las construcciones putativas Q80, Q52, Q31 y Q10-GFP, respectivamente
Diseñamos una secuencia polyQ que contenía 80 repeticiones de glutamina (Q80). La secuencia fue diseñada para tener una baja similitud de repetición intercalando aleatoriamente tripletes CAG que codifican glutamina con tripletes CAA que codifican glutamina (Fig. 1b, c). Las sustituciones de nucleótidos se hicieron a ojo para generar un patrón semi aleatorio. Este diseño de secuencia no repetitiva no sólo debería mejorar la estabilidad de la secuencia durante la propagación en bacterias, sino que también permitió el diseño de cebadores de PCR que se anejan a regiones específicas de la secuencia.
La construcción Q80-GFP-v2A-GFP descrita anteriormente se sintetizó comercialmente (Biomatik Corporation) (véase el archivo adicional 1) y se subclonó a través de los sitios de restricción BamHI y ClaI en el vector de transferencia génica basado en el transposón Tol2, pT2AL200R150G (en lo sucesivo denominado Tol2) disponible en el laboratorio Kawakami (Fig. 1a y véase el archivo adicional 2).
Las construcciones PolyQ con menor número de repeticiones de glutamina se generaron mediante amplificación por exclusión basada en PCR de la construcción Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. Los cebadores se diseñaron para amplificar alrededor del vector excluyendo un número definido de repeticiones de glutamina para generar las construcciones de interés (Fig. 1d-f). Nuestro objetivo era generar vectores con aproximadamente 52 (Q52), 31 (Q31) y 10 (Q10) repeticiones de glutamina. Los vectores putativos Q52 y Q31 se generaron utilizando el mismo cebador inverso acoplado a diferentes cebadores delanteros. Este cebador inverso común amplificó 2 repeticiones de glutamina, mientras que los cebadores delanteros amplificaron las 50 y 29 repeticiones de glutamina adicionales necesarias para generar los vectores Q52 y Q31, respectivamente. La posición del cebador inverso se desplazó ligeramente para optimizar la amplificación del vector putativo Q10, de manera que el cebador inverso amplificó ahora 5 repeticiones de glutamina, mientras que el cebador directo amplificó las 5 repeticiones de glutamina restantes (Fig. 1d-f). Utilizando temperaturas de recocido estrictas en la reacción de PCR obtuvimos una unión específica del cebador. Los productos de PCR extraídos y purificados en gel fueron fosforilados, circularizados por autoligado y posteriormente transformados en células competentes (véase el archivo adicional 3). La PCR utilizando cebadores que flanqueaban la región poliQ mostró los tamaños de producto aproximadamente esperados para los vectores putativos Q52, Q31 y Q10 previstos (Fig. 1g). Las construcciones generadas se secuenciaron para determinar si los números de repetición polyQ esperados estaban presentes. Mientras que el constructo Q52 tenía el número esperado de repeticiones de glutamina (Fig. 2a, b), la secuenciación reveló discrepancias menores con los números de poliQ esperados para los otros dos constructos, en los que el vector Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP tenía 21 repeticiones de glutamina (en lo sucesivo denominado Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2c, d) y el vector Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP tenía 11 repeticiones de glutamina (en adelante Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2e, f). Un análisis más detallado reveló que la secuencia Q21 generada derivaba directamente de la secuencia original y que la pérdida de repeticiones de glutamina se debía a que el cebador Q31 se unía 30 pb aguas abajo del sitio de unión previsto. En cambio, la repetición de glutamina adicional en la secuencia Q11 se generó de novo, una adición de un codón CAA.
Mapa vectorial y análisis de la secuencia de las construcciones que codifican para Q52, Q21 y Q11-GFP generadas por amplificación de escisión basada en PCR. a Mapa vectorial de la construcción Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP. b Cromatografía de la construcción Q52. c Mapa vectorial de la construcción Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP. d Cromatografía de la construcción Q21. e Mapa vectorial de la construcción Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP. f Cromatografía de la construcción Q11
Para estudiar la cinética de agregación y el «flujo autofágico» de la proteína polyQ in vivo, inyectamos los vectores polyQ generados (25 ng/μL) y el ARNm de la transposasa (25 ng/μL) en grupos de embriones de pez cebra de una etapa (Fig. 3a, b). Se realizó un análisis de Western blot con un anticuerpo anti-GFP de lisados de embriones de 24 h posfecundación (hpf) (10 embriones por muestra) para cada grupo. Se incluyeron como controles el vector Tol2 vacío (25 ng/μL) y el ARNm de la transposasa (25 ng/μL) inyectados y los embriones no inyectados. Los embriones inyectados con las construcciones polyQ produjeron dos bandas detectadas por el anticuerpo anti-GFP como se esperaba; GFP unida a polyQ (polyQ80-GFP a ~ 48 kDa, polyQ52-GFP a ~ 38 kDa, polyQ21-GFP a ~ 33 kDa y polyQ11-GFP a ~ 31 kDa), y GFP libre (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Cada una de las construcciones de polyQ-GFP que expresan lisados de embriones también mostraron una banda más tenue de mayor tamaño proteico correspondiente a la construcción de polyQX-GFP-v2A-GFP de longitud completa (polyQ80-GFP-v2A-GFP a ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP a ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP a ~ 60 kDa, y polyQ11-GFP-v2A-GFP a ~ 58 kDa). Esta banda representa el ~ 10% de la proteína total que se traduce como una única proteína de longitud completa cuando se utiliza el sistema de secuencia v2A . Las proporciones Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP y Q11-GFP:GFP son ~ 5, ~ 4, ~ 2 y ~ 1, respectivamente (Fig. 3d). Como la secuencia v2A permite la traducción estequiométrica de las proteínas polyQ-GFP y GFP, en teoría la proporción polyQ-GFP:GFP debería ser 1. Las proporciones mayores observadas pueden indicar una acumulación de esas proteínas. Estas observaciones están de acuerdo con la literatura, donde se ha demostrado que las construcciones de fusión polyQ-GFP que contienen más de 19 residuos de glutamina se agregan dentro de las células transfectadas de una manera dependiente de la longitud . Estas observaciones nos llevan a concluir que nuestras construcciones Tol2-QX-GFP-v2A-GFP proporcionan una herramienta útil para estudiar el «flujo autofágico» in vivo en un modelo de pez cebra larvario.
Análisis de la expresión del constructo Tol2-QX-GFP-v2A-GFP en D. rerio. Se inyectaron embriones de pez cebra con 25 ng/µL de la construcción Tol2-QX-GFP-v2A-GFP y 25 ng/µL de ARNm que codifica la transposasa Tol2. a Imágenes de campo claro (paneles superiores) y fluorescentes (paneles inferiores) de la vista lateral izquierda de las regiones de la cabeza y el tronco del embrión de pez cebra que expresan Q80, Q52, Q21 y Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Imágenes de campo claro (paneles superiores) y fluorescentes (paneles inferiores) de la vista lateral izquierda de las regiones del tronco y la cola del embrión de pez cebra que expresan Q80, Q52, Q21 y Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Análisis de Western blot de la expresión de las construcciones Qx-GFP en D. rerio. Las proteínas se aislaron de embriones de ~ 24 hpf que expresaban las construcciones Q80, Q52, Q21 y Q11-GFP. Las proteínas se resolvieron en un gel de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se sondeó con un anticuerpo anti-GFP. El vector Tol2 «vacío» posee un gen GFP expresado que se sustituye durante la inserción del constructo. d Cuantificación de Western blot. Se presenta la intensidad de la GFP para cada banda numerada del Western blot y la relación entre la Qx-GFP y la GFP libre
Conclusión
En conclusión, este estudio proporciona una solución robusta y fácilmente adoptable para generar longitudes cercanas a las previstas de repeticiones de poliQ. Para generar un número exacto de repeticiones de glutamina se pueden llevar a cabo rondas posteriores de amplificaciones con secuencias de cebadores alteradas. Además, la longitud del cebador puede aumentarse para mejorar la especificidad del recocido del cebador en el molde. Nuestra técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes para la amplificación de regiones repetitivas basada en la PCR y pretende minimizar la generación de productos de PCR inespecíficos y de repeticiones defectuosas aprovechando la redundancia de codones del código genético para generar una secuencia codificadora de ADN sinónima con una repetición reducida. Además, nuestro enfoque no se limita a generar secuencias de repetición poliQ, sino que también puede generalizarse para generar otras secuencias de repetición de nucleótidos. Además, nuestro método es relativamente barato, ya que sólo la construcción inicial polyQ80-GFP-v2A-GFP requiere una síntesis comercial, cuyo coste depende del precio por base nucleotídica, la longitud, la pureza y la masa. Todos los demás materiales necesarios son reactivos estándar utilizados para la clonación molecular. En resumen, la técnica descrita proporciona una solución fácil de adoptar y asequible para generar secuencias de ADN de codificación repetida que pueden ser manipuladas según sea necesario.