- What te kiezen voor Microbiome Studies
- Wat is 16S rRNA-gen sequencing?
- Wat is shotgun metagenomic sequencing?
- 16S/ITS sequencing vs. shotgun metagenomic sequencing
- Taxonomieresolutie
- Functionele profilering
- Microbiële dekking en aanbevolen monstertype
- False positieven
- Storing van gastheer-DNA
- DNA input
- Here to Help
- Ontdek welke sequencing-methode voor u het beste is. Praat met de deskundigen van de ZymoBIOMICS Sequencing Services.
What te kiezen voor Microbiome Studies
16S sequencing of shotgun sequencing? Bijna alle microbioom onderzoekers stellen zich deze vraag bij het plannen van een nieuwe studie, omdat de overgrote meerderheid van de microbioom publicaties ofwel 16S rRNA-gen sequencing of shotgun metagenomic sequencing gebruiken om ruwe gegevens te genereren voor latere microbiële profilering of metagenomics analyses. Elke methode heeft zijn voors en tegens, dus welke methode moet u kiezen?
Wat is 16S rRNA-gen sequencing?
16S rRNA-gen sequencing, of gewoon 16S-sequencing, maakt gebruik van PCR om delen van de hypervariabele regio’s (V1-V9) van het bacteriële 16S rRNA-gen te selecteren en te amplificeren1. Amplicons van afzonderlijke monsters krijgen dan moleculaire streepjescodes, worden samengevoegd en gesequeneerd. Na sequencing worden de ruwe gegevens geanalyseerd met een bioinformatica-pijplijn die trimmen, foutcorrectie en vergelijking met een 16S-referentiedatabank omvat. Nadat de gegevens aan een fylogenetische rangorde zijn toegewezen, kan een taxonomieprofiel worden gegenereerd. ITS-sequencing volgt dezelfde strategie, maar richt zich op de ITS-regio (Internal transcribed spacer) die in de genomen van schimmels wordt aangetroffen.
Wat is shotgun metagenomic sequencing?
In tegenstelling tot 16S-sequencing, dat zich alleen op 16S rRNA-genen richt, sequenteert shotgun metagenomic sequencing al het gegeven genomische DNA van een monster. De workflow voor de voorbereiding van de bibliotheek is vergelijkbaar met die voor gewone sequencing van het volledige genoom, met inbegrip van willekeurige fragmentering en adapterligering. Een typische workflow voor taxonomieanalyse van shotgun metagenomische gegevens omvat het trimmen van de kwaliteit en vergelijking met een referentiedatabank die volledige genomen (bv. Kraken2 en Centrifuge3) of geselecteerde markergenen (MetaPhlAn4 en mOTU5) bevat om een taxonomieprofiel te genereren. Omdat shotgun metagenomische sequencing alle genetische informatie in een monster bestrijkt, kunnen de gegevens worden gebruikt voor aanvullende analyses, bv. metagenomische assemblage en binning, profilering van metabolische functies en genprofilering van antibioticaresistentie.
16S/ITS sequencing vs. shotgun metagenomic sequencing
Als uw studie genomische analyses vereist die verder gaan dan taxonomieprofilering, zoals metabole padanalyse, moet u shotgun metagenomic sequencing overwegen vanwege de grotere genomische dekking en gegevensoutput. Als samenstelling profilering is het belangrijkste doel van de studie, beide technieken hebben voors en tegens te overwegen (tabel 1).
Taxonomieresolutie
De taxonomieresolutie van 16S/ITS-sequencing hangt af van de variabele regio’s waarop men zich richt, het organisme zelf en het algoritme voor de sequentieanalyse. De laatste jaren hebben sommige foutcorrectiemethoden, bv. DADA26, de nauwkeurigheid en taxonomieresolutie van deze techniek drastisch verbeterd. Met DADA2 is een resolutie op soortniveau voor veel organismen met gewone 16S-sequencing nu een realiteit. Maar in theorie kan shotgun metagenomic sequencing een resolutie op stamniveau bereiken omdat het alle genetische variaties kan bestrijken. Hoewel in de praktijk de nauwkeurigheid van stamniveau-resolutie nog steeds op technische uitdagingen stuit. Toch wordt met shotgun metagenomic sequencing een hogere resolutie bereikt dan met 16S/ITS sequencing.
Functionele profilering
Als metabole functie-analyse een doel is, zullen de meeste onderzoekers 16S en ITS sequencing snel over het hoofd zien. Maar er zijn enkele hulpmiddelen om metabole functies uit taxonomiegegevens af te leiden, bijvoorbeeld PICRUSt7. Maar in het algemeen wordt shotgun metagenomische sequencing vaak gebruikt wanneer functionele profilering vereist is vanwege de extra genendekking.
Microbiële dekking en aanbevolen monstertype
Shotgun sequencing onderzoekt al het metagenomisch DNA terwijl 16S sequencing alleen 16S rRNA genen onderzoekt, die ook te lijden heeft van onvolledige primerdekking. Bijgevolg heeft eerstgenoemde sequencing een grotere gebiedsoverschrijdende dekking. Waarom wordt dan in tabel 1 16S/ITS-sequencing als beter in bacteriële en fungi-dekking aangegeven? Dit vloeit voort uit de soortendekking van beschikbare referentiedatabanken omdat de taxonomievoorspelling van deze sequencingbenaderingen sterk afhangt van de gebruikte referentiedatabank. Momenteel is de dekking van 16S/ITS-databases veel beter dan die van databases met volledige genomen. Dit komt doordat de volledige genomen van microben die geassocieerd zijn met het menselijke microbioom veel beter bestudeerd zijn dan genomen van microben die geassocieerd zijn met andere omgevingen. Dit is de reden waarom het wordt aanbevolen om shotgun metagenomische sequencing te gebruiken voor mens-microbioom-gerelateerde monsters, zoals feces en speeksel, als taxonomie profilering het hoofddoel is.
Bovendien heeft metagenomische sequencing een grotere afhankelijkheid van de referentiedatabase. Als een bacterie bijvoorbeeld geen nauw verwante vertegenwoordiger in de 16S-referentiedatabase heeft, kan deze misschien op een hogere fylogenetische rang worden geïdentificeerd of als een onbekende bacterie. Maar in het geval van shotgun metagenomische sequencing, als een bacterie geen nauwe verwant (een genoom van hetzelfde genus) in de referentiegenoomdatabase heeft, is de kans groot dat je hem helemaal mist. De ZymoBIOMICS Spike-in Control I bevat bijvoorbeeld twee microben die vreemd zijn aan het menselijke microbioom (Imtechella halotolerans en Allobacillus halotolerans), waarvan de genomen vroeger niet beschikbaar waren. Als je die in een fecaal monster injecteert en sequentieert met shotgun-sequencing, zullen de meeste bioinformaticapijplijnen ze volledig missen, tenzij je deze twee genomen manueel aan de referentiedatabank toevoegt. Anderzijds, indien geanalyseerd met 16S-sequencing, zullen ze worden geïdentificeerd als gevolg van de aanwezigheid van hun 16S-sequentie in referentiedatabases.
False positieven
Error-correctie tools, zoals DADA2, verbeteren niet alleen de taxonomie resolutie van 16S/ITS-sequencing, maar ze verbeteren ook de nauwkeurigheid. Dit wordt aangetoond bij het sequencen van DNA van de mock microbiële gemeenschap (bv. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Alle 16S-sequenties worden teruggevonden zonder dat de sequentie een fout vertoont, d.w.z. zonder valse positieven. Maar bij shotgun metagenomische sequencing is het waarschijnlijk dat, tenzij er een perfect representatief genoom in de referentiedatabank voor een gesequenteerde microbe bestaat, de bio-informatica-analyse het bestaan van meerdere “nauw verwante” genomen voorspelt. Deze nauw verwante genomen kunnen afkomstig zijn van verschillende soorten van hetzelfde genus of zelfs van verschillende genus. Stel bijvoorbeeld dat er drie nauw verwante microben zijn, A, B en C, en dat zij enkele sequenties gemeen hebben. Soort A deelt sommige sequenties alleen met B en sommige andere sequenties alleen met C. Als de referentiedatabank alleen genomen van B en C bevat, zal de bio-informatica bij sequentiebepaling van A voorspellen dat zowel B als C aanwezig zijn. Zowel A als B zouden bijvoorbeeld stammen van Escherichia coli kunnen zijn en C is Salmonella enterica; de sequenties die B en C op unieke wijze delen, kunnen het gevolg zijn van een horizontale genoverdracht, die gebruikelijk is tussen nauw verwante microben. Daarom is 16S/ITS-sequencing beter met betrekking tot vals-positieven.
Storing van gastheer-DNA
De aanwezigheid van te veel gastheer-DNA kan niet-specifieke amplificatie veroorzaken in het bibliotheekvoorbereidingsproces van 16S- en ITS-sequencing, maar het effect is beheersbaar door de PCR-cycli aan te passen en primers te veranderen. Anderzijds is de interferentie van gastheer-DNA een veel moeilijker probleem voor shotgun metagenomische sequencing, ook al is de kostprijs van sequencing drastisch gedaald. Afhankelijk van het monstertype kunnen sommige monsters >99% menselijk gastheer-DNA bevatten, wat niet alleen de sequentiekost verhoogt maar ook onzekerheid in de meting introduceert. Dit is de reden waarom veel onderzoekers kijken naar gastheer DNA depletie, bijvoorbeeld HostZERO Microbieel DNA Kit, vóór de bibliotheek voorbereiding van shotgun sequencing. Het is echter mogelijk dat er niet voldoende microbieel genomisch DNA overblijft voor shotgun sequencing na depletie van gastheer-DNA, waarvoor doorgaans een minimuminput van 1ng vereist is. De interferentie van gastheer DNA is de reden waarom ondiepe shotgun sequencing wordt alleen aanbevolen voor menselijke fecale samples.
DNA input
While Shotgun metagenomic sequencing vereist 1 ng DNA-input in minimum, 16S/ITS sequencing is veel gevoeliger met input minima zijn femtogrammen of zelfs zo laag als 10 kopieën van 16S rRNA genen.
Here to Help
De keuze tussen 16S sequencing en shotgun metagenomic sequencing is een kritische stap voor alle microbioom studies. Naast het budget moeten vele aspecten van het project in overweging worden genomen, waaronder het type monster, de gewenste analyses, de resolutie van de taxonomie en de doelorganismen. Door met deze overwegingen rekening te houden, kunt u de juiste sequencingmethode kiezen voor uw volgende microbioomproject. De microbiome sequencingdiensten van ZymoBIOMICS bieden 16S-, ITS- en shotgun-sequencing als complete diensten, van DNA-extractie tot sequencing en bio-informatica. De sequencing- en bioinformatica-experts van Zymo Research helpen u graag bij het kiezen van de juiste sequencing-methode voor uw studie.
Ontdek welke sequencing-methode voor u het beste is. Praat met de deskundigen van de ZymoBIOMICS Sequencing Services.
Learn More
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrasnelle metagenomische sequentieclassificatie met behulp van exacte alignments. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: snelle en gevoelige classificatie van metagenomische sequenties. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: High resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13 november 2019