Analyse en beschrijving van de stadia van Aspergillus fumigatus biofilmvorming met behulp van scanning elektronenmicroscopie

Medisch gezien is Aspergillus fumigatus een opportunistische ziekteverwekker van immuungecompromitteerde personen, met een ziekte-ernst die afhangt van de immuunstatus van de gastheer, met een mortaliteitspercentage van 50-95 %. Deze schimmel geeft aanleiding tot lokale infecties, zoals dermatomycose van de nagels of schimmelkeratitis, en tot invasieve infecties, zoals aspergillose, en is de tweede meest voorkomende oorzaak van schimmelinfecties bij gehospitaliseerde patiënten. A. fumigatus-infectie in de luchtwegen kan longschimmelbal, invasieve aspergillose, invasieve pulmonale aspergillose (IPA), overgevoeligheidspneumonitis, astma, immunoglobuline E-gemedieerde allergische rhinitis, chronische necrotiserende longontsteking of allergische bronchopulmonale aspergillose (ABPA) veroorzaken. Bovendien geeft het aanleiding tot osteomyelitis en endocarditis.

A. fumigatus ontwikkelt een biofilm die één van de belangrijkste virulentiefactoren kan zijn. A. fumigatus biofilm ontwikkelt mycelia ingebed in een EMC in vitro, en biofilmvorming is beschreven in menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) en cystische fibrose bronchiale epitheelcellen (CFBECs) en in patiënten met cystische fibrose . Schimmelbiofilmvorming op katheters en prothesen draagt bij aan de ontwikkeling van nosocomiale infecties. De persistentie van schimmelinfecties is dus te wijten aan het vermogen van een schimmel om biofilms te vormen op een grote verscheidenheid aan medische hulpmiddelen en omdat de persisterende cellen een belangrijk resistentiemechanisme vormen. Voor de behandeling van een gevestigde biofilm in de gastheer moeten gewoonlijk toxische concentraties antimicrobiële stoffen worden toegediend, en de aanbevolen behandeling omvat de verwijdering van het besmette hulpmiddel; dit is echter een moeilijk en kostbaar proces. Daarom vormen schimmelbiofilms een groot klinisch en economisch probleem.

In het laatste decennium zijn verschillende studies gepubliceerd over de biofilm van A. fumigatus, zowel in vivo (in muismodellen, in patiënten met invasieve longaspergillose en in primaire humane epitheliale culturen) als in vitro (op polystyreenplaten). In het algemeen betreffen deze studies vooral het rijpheidsstadium van de biofilm en de chemische samenstelling van de ECM, met weinig beelden van de biofilmstadia, maar elk van deze beschreef alle stadia van biofilmvorming. De informatie verschilt dus van de bijdragen van onze werkgroep.

De belangrijkste bijdragen van deze studie zijn de volgende: i) we geven een beschrijving van alle stadia in de biofilmvorming van A. fumigatus in vitro, in de tijd, en de stadia worden ondersteund met SEM beelden; ii) we analyseerden twee verschillende herkomsten van isolaten: een uit de omgeving en een van een patiënt met een hoornvlieszweer; iii) we rapporteren micro-hyphae (klinisch isolaat) en schimmelstructuren die tot op heden nauwelijks zijn gerapporteerd en die, voor zover ons bekend, niet zijn beschreven voor de Aspergillus soorten; en iv) we geven een beschrijving van de dispersiestap voor de vorming van biofilm kolonisatie op nieuwe punten.

Om de structurele organisatie van de rijpe biofilm van A. fumigatus (24 uur incubatie bij 28 °C en 37 °C) te analyseren, werden twee stammen, een uit de bodem en een andere van een patiënt met schimmelkeratitis, onderzocht met SEM. Een overzicht van de A. fumigatus biofilmvorming geobserveerd in dit onderzoek was dat deze biofilms zich gelijkaardig gedroegen, ongeacht of het isolaat afkomstig was van de bodem of van de kliniek; er waren echter verschillen naargelang de incubatietemperatuur. Bij 28°C vertoonde de biofilm stadia gelijkaardig aan die beschreven in klassieke microbiële groei: de lag-, exponentiële- en stationaire fasen; de biofilmgroei was traag en stabiel met een lage ECM-productie, en de schimmelstructuur was eenvoudig (Fig. 1). Bij 37 °C vertoonde de prestatiecurve een nogal variabele lag (adaptatie) en log (exponentiële) fase, wat een reactie zou kunnen zijn op stress als gevolg van de incubatie bij een hoge temperatuur; bij 37 °C is er dus een vermindering van de adaptatiefase (lag) om de schimmel levensvatbaar te houden; ook de logfase, met een discontinue toename en met beide gedragingen is waarschijnlijk een adaptieve reactie. Zo waren er bij 37°C tijdens de rijpingsfase uiterst georganiseerde myceliastructuren, en deze waren gereduceerd en verdicht met hyfen die verdikt waren en versmolten tot anastomose, en het ECM was overvloedig in zijn bedekking, omgeving en versterking van de schimmelstructuren (Figs. 3 en 4).

In deze studie leveren wij bewijs van de A. fumigatus biofilm stadia door SEM. De stadia die tijdens de biofilmvorming werden waargenomen, waren de volgende:

Aanhechting, celcoaggregatie en EPS-productie

In een vroeg stadium (Fig. 2/4 h) hechten conidia zich aan het plaatoppervlak door een interactie van elektrostatische krachten tussen de structurele componenten van de schimmelcelwand, en deze aantrekkingskracht is zwak en daarom omkeerbaar. Onomkeerbare en permanente binding is op grote schaal beschreven in specifieke bacteriële adhesines aanwezig op het celoppervlak, die zich binden aan het substraat en EPS, dat zijn stoffen die door het micro-organisme worden geproduceerd in de eerste stadia van de biofilmvorming en die functioneren in de hechting van de cellen aan elkaar en aan het substraat en zijn samengesteld uit eiwit-koolhydraat complexen en glycoproteïnen die voornamelijk structurele of adhesieve functies uitvoeren. Adhesines zijn betrokken bij de herkenning van bacteriecellen onderling, met inbegrip van het bouwen van bruggen en het initiëren van kolonievorming . Adhesines zijn beschreven bij de adhesie van schimmels tijdens biofilmvorming. In Candida albicans, Candida glabrata en Candida tropicalis biofilms is er een groep adhesiegenen betrokken bij biofilmvorming die behoren tot de agglutinine-achtige sequentie (ALS) familie, die een sleutelrol speelt in dit proces en codeert voor eiwitten die de kenmerken bezitten van adhesine-glycoproteïnen op het celoppervlak. De ALS-familie in C. albicans omvat acht genen (ALS1-ALS7 en ALS9) die coderen voor een groot aantal oppervlakte-glycoproteïnen. In A. fumigatus zijn zes hydrofobines, bestaande uit de rodlets RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp en RodFp, geïdentificeerd op het oppervlak van conidia. Deze hydrofobe eigenschap maakt de hechting aan eiwitten van gastheercellen mogelijk, en zij zouden betrokken kunnen zijn bij de hechting aan het oppervlak van de polystyreenplaat en het op gang brengen van het proces van biofilmvorming in alle of slechts in twee of drie van deze . Daarnaast hebben Gravelat en medewerkers deze schimmelinteractie beschreven, en zij ontdekten dat het adhesine MedA de hechting aan de polystyreenplaat, de biofilmvorming en de expressie van de conidiatiegenen regelt en dat het een hard effect heeft op het conidiatieproces bij A. fumigatus . Adhesie, als gevolg van de interactie tussen schimmeladhesines en het plaatoppervlak, en adhesie conidium-conidium brengt waarschijnlijk signalisatie op gang en bevordert celcoaggregatie en EPS-productie, en deze gebeurtenissen worden weergegeven in Fig. 2 (4 u). Tegelijkertijd versnelt EPS de schimmelkolonievorming door de hechte binding van de cellen (Fig. 2 (8-12 h)) .

Conidiumkieming tot hyphen en ontwikkeling

Biofilmvorming vereist een drempelaantal cellen om hen in staat te stellen te worden waargenomen en een reactie te genereren, wat een regulerend mechanisme van genexpressie met specifieke functies is . Bij de biofilmvorming van A. fumigatus, vóór het begin van de kieming van de conidia, is het conidia-oppervlak uitgesproken hydrofoob en bestaat het voor 40 % uit hydrofobe methylgroepen. A. fumigatus conidiaalkieming resulteert in de verstoring van de hydrofobe proteïnerijkerodletlaag en onthult binnenste conidiumwanden die hoofdzakelijk bestaan uit polysacchariden, die hydrofiele celwandcomponenten zijn. Op een enkele kiemende spore bevindt zich een hydrofobe top. Het conidium verliest geleidelijk zijn oppervlaktehydrofobiciteit en daarna vertoont de nieuwe groeipunt een coëxistentie van hydrofobe staafjes en hydrofiele polysacchariden. De kieming van conidiën tot hyphen begint met de vorming van kiembuisjes, zoals geïllustreerd in Fig. 2 (8-12 u), die de zeer hydrofiele aard van de celwand bezitten, en waarvan verwacht wordt dat ze de hyphale groei bevorderen.

Biofilmrijping

A. fumigatus biofilmrijping werd waargenomen na 24 u, wat een incubatietijd is die vergelijkbaar is met die gerapporteerd door andere onderzoekers. De structurele componenten omvatten de ECM, die in de rijpe biofilm aanwezig is en de cellen bindt om de structurele basis van de biofilm te vormen, met inbegrip van het EPS en vele georganiseerde mycelia (Fig. 2 (24 h0) . ECM. Water is het meest overvloedige bestanddeel en bedraagt in de biofilm bijna 97 %. In dit vochtige milieu bevindt zich een geordend macromoleculair netwerk. De belangrijkste beschreven functies voor EPS in bacteriële biofilms zijn: adhesie, celaggregatie, cohesie; waterretentie, een beschermende barrière als specifieke gastheerafweer of antimicrobiële agentia, absorptie van organische verbindingen en anorganische ionen, enzymatische activiteit, voedingsbron, uitwisseling van genetische informatie, elektronendonor of -acceptor, export van celbestanddelen, opslag van overtollige energie retentie, en de stabilisatie van enzymen . In schimmelbiofilms zijn al deze functies nog niet beschreven, maar een aantal ervan wordt bestudeerd: de cohesieve en adhesieve krachten van de matrix dragen bij aan de architectonische en mechanische stabiliteit van de biofilm. Schimmelcellen zijn geïmmobiliseerd in de matrix en fungeren als een functionerend ecosysteem dat voortdurend verandert en homeostatisch reguleert met intense interacties, inclusief cel-cel communicatie, die fungeert als de lijm die de cellen bij elkaar houdt . De structuur van de biofilm varieert sterk naargelang het micro-organisme dat hem produceert en de omstandigheden waarin hij zich bevindt, met inbegrip van de structurele verschillen die samenhangen met de klinische presentatie. Tijdens de infectieuze processen ondersteunt de ECM de bescherming tegen de gastheer en de resistentie van de micro-organismen tegen geneesmiddelen; de ECM is dus niet alleen een mechanisch kader, maar ook een regulator van het celgedrag. De hydrofobe eiwitten van de matrix binden zich met de specifieke receptoren op het celoppervlak, wat leidt tot cel-matrixadhesie, die een effect heeft op celvorm, migratie, proliferatie, celoverleving en metabolisme. Bovendien beschermt de ECM de cellen tegen milieu-invloeden, waaronder uitdroging, ultraviolet (UV), straling, oxidatie, verhongering, de werking van predatoren en de immuunafweer van de gastheer en antibiotica. De ECM-kenmerken waren duidelijk in Fig. 2 (24 u) en Fig. 3 en hechtten zich aan de schimmelhyfen tot een aaneengesloten omhulsel en werden ook waargenomen met een poreuze consistentie (Fig. 2 (24 u)). In de A. fumigatus biofilm was het EPS sterk gestructureerd en had het een overvloedige productie, die de schimmelstructuren bedekte, omringde en versterkte; het fungeerde als een cohesief voor het samensmelten van hyphae-hyphae structuren (enkel 37°C). Het EPS ontstaat met een slijmachtig uiterlijk dat zich volledig vasthecht en de hyfen bedekt, anastomose veroorzaakt en het lumen van de waterkanalen afsluit (Fig. 2 (24 h), 3, en 4). In eerdere studies beschreef onze werkgroep het rijpingsstadium van de A. fumigatus biofilm, waarin soortgelijke structuren werden waargenomen.

In sommige micro-consortia is de chemische samenstelling van EPS bekend (o.a. koolhydraatpolymeren, DNA en/of eiwitten en, lipiden), maar andere moeten nog worden geïdentificeerd. Het oppervlak van A. fumigatus is opgebouwd uit α-1,3-glucanen, chitine, chitosan, galactomannaan, galactosaminogalactaan, melanine en eiwitten. De samenstelling en structurele organisatie van de celwand wordt voortdurend herschikt; ook al zijn de aanwezige polysacchariden dezelfde, hun hoeveelheid en lokalisatie variëren naargelang van de groeiomstandigheden en het voedingsmilieu. Hierin toonden wij de chemische samenstelling van A. fumigatus biofilm, die werd waargenomen door de co-lokalisatie van fluorochromen gehecht aan chitine, metabole activiteit en nucleïnezuren door CLSM; bovendien werd de overlapping van de fluorochrome signalen waargenomen wanneer deze gehecht twee of drie van deze (Fig. 5). De functie die beschreven werd voor polysacchariden, zoals α 1,3-glucanen, bestond erin dat zij in vitro een overheersende rol speelden in de hyphale aggregatie en in de hyphale aggregatie in biofilms. Van andere polysachariden van het ECM, waaronder galactomannaan en galactosaminogalactaan, is eveneens bekend dat zij een rol spelen bij de bescherming van de schimmel, en bij de hechting van zijn biofilmstructuren aan oppervlakken . Extracellulair DNA (eDNA) is een belangrijke component van de ECM biofilm die de structurele en architecturale integriteit van A. fumigatus in stand houdt. Het eDNA ontstaat door autolyse en is significant geassocieerd met de mate van antischimmelresistentie (Fig. 5). Bovendien kan eDNA een reservoir van genen zijn voor horizontale genoverdracht. DNA zorgt voor een meer solide en resistente structurele organisatie wanneer het gelokaliseerd is met polysacchariden. eDNA is afkomstig van schimmelcellen door de secretie van chitinases door A. fumigatus waardoor het vrijkomt (Fig. 5) . In de biofilm heeft de modificatie van de celwand een essentiële invloed op de resistentie tegen celwandmedicijnen. In A. fumigatus, in een biofilmmodel in de muis, werd het gen voor multidrug-resistente (MDR) effluxpompen AfuMDR4, dat geassocieerd is met de uitvoer van antimicrobiële middelen, significant geïnduceerd door behandeling met Voriconazole na 24 uur . De FUN1-marker onthulde metabolische activiteit die een levende gemeenschap is (Fig. 5).

Mycelia: De biofilm vertoont een complexe 3-dimensionale (3-D) structuur die een gecoördineerd cellulair proces weerspiegelt; myceliale ontwikkeling en uitbreiding waren duidelijk, die verdichte hyphal-laag netwerken, hypha-hypha adhesie, anastomosis inbegrepen bij beide temperaturen, met een optimale ruimtelijke-arrangement gevormde kanalen om instroom van voedingsstoffen en uitstroom van afvalstoffen te bieden en dus stabiliseert de biofilm; bij 37 ° C, dit kanaal was meer duidelijk (Figs. 2 (24 h), 3, en 4). Deze structuren werden ook door andere onderzoekers waargenomen. Microhyphae: In de vroege stadia van de rijping van de biofilm werden onregelmatige schimmelstructuren, zoals microhyphae, in het klinische isolaat waargenomen (Fig. 4). Dit feit is relevant omdat er in de literatuur nauwelijks verwijzingen zijn naar microhyphae, en dit is de eerste keer dat ze beschreven werden bij A. fumigatus. Microhyphae vertonen cytoskeletveranderingen waardoor korte en slanke hyphae ontstaan met dunne wanden en met gebogen uiteinden. Microhyphae worden geassocieerd met een hoge enzymatische activiteit die het rijpingsproces en het daaropvolgende biofilmstadium celdispersie bevordert.

Celdispersie

Tijdens celdispersie wordt een deel van de biofilm losgemaakt, het deel dat de conidia of hyphae omvat. Asynchrone biofilmontwikkeling werd waargenomen, vooral in het biofilm-maturatiestadium wanneer de nieuwe conidia in staat waren te ontkiemen, nieuwe myceliale groei te produceren en hyphale wijzigingen, zoals krullen, aan te brengen (Figs. 4 en 6). Celverspreiding van de biofilm treedt op als reactie op veranderingen in het milieu. Dit werkt om een gevaarlijke stof uit het hoofdlichaam van de biofilm te verwijderen. Dit proces leidt tot de verspreiding en voortplanting van de inwonende biofilmcellen op een nieuwe locatie, hetgeen wordt ondersteund door complexe moleculaire gebeurtenissen. Biofilms kunnen worden gezien als beschermende omhulsels van de levende cellen eronder, met uiterst complexe en ontelbare functies, en dus zijn het werkelijk opmerkelijke biologische constructies. Biofilms bieden bescherming tegen predatie of chemische aanvallen en bieden de binnenste cellen een medium voor intracellulaire communicatie, voedingsstoffenstroom en de overdracht van genetisch materiaal. De celdispersie verspreidt levensvatbare cellen naar andere plaatsen in de omgeving of binnen een gastheer waar de cellen zich kunnen reproduceren, en vergemakkelijkt zo de persistentie. Celdispersie treedt op als gevolg van schaarse voedingsstoffen in het milieu, en is dus een overlevingsmechanisme. Daarom is celdispersie niet alleen belangrijk voor de bevordering van genetische diversiteit, maar ook voor het ontsnappen aan ongunstige habitats, waardoor nieuwe niches kunnen worden ontwikkeld en het micro-organisme op een nieuwe locatie kan overleven.