Antisense Oligonucleotides Targeted to SMN2
ASO’s zijn enkelstrengs nucleïnezuren die worden gesynthetiseerd om complementair te zijn aan een doel-RNA-sequentie. Eenmaal toegediend, wordt de ASO in de cel opgenomen via een nog slecht gedefinieerd endocytisch mechanisme en komt dan in de celkern terecht waar het zich bindt aan zijn doel-pre-mRNA.62 Aanvankelijk werden ASO’s gebruikt om genexpressie te onderdrukken, hetzij door de translatie van een RNA-doelwit te blokkeren, hetzij door de afbraak ervan te bevorderen. Tegenwoordig kunnen ASO’s ook worden ontworpen om de verwerking of splicing van een doelwit te veranderen. SMA therapeutische ASO’s zijn ontworpen om de alteratieve splicing van SMN2 pre-mRNA te wijzigen, zodat exon 7 wordt opgenomen in het uiteindelijke verwerkte transcript. Zoals in eerdere hoofdstukken besproken, verschilt SMN2 van SMN1 door een C-naar-T overgang die plaatsvindt zes nucleotiden in exon 7 (er zijn andere verschillen tussen de twee sequenties, maar dit is functioneel het belangrijkst). De C-to-T overgang creëert een verlengde remmende context in exon 7 (ook bekend als “Exinct”).63 Omdat exon 7 verder zwak gedefinieerd is als gevolg van een zwakke 5′-splitsingsplaats, is de C-to-T mutatie in SMN2 voldoende om de balans te doen doorslaan van insluiting naar uitsluiting.
Splicing regulerende elementen spelen een belangrijke rol bij het bepalen welke plaatsen worden herkend door de cellulaire splicing machinerie. De plaats en functie van relevante SMN2-elementen werden geïdentificeerd door analyse van het splicing-effect van een uitgebreide reeks ASO’s die waren ontworpen om de SMN2-sequentie op een progressieve iteratieve wijze aan te vullen.63-66 De intronic splicing silencer ISS-N1 werd via deze methode geïdentificeerd als een zeer krachtig silencing element; het motief bevindt zich downstream van de 5′-splice site van exon 7 en bindt zich aan splicing repressor hnRNP A1.66-68 ASO’s zijn ontworpen om betrouwbaar exon 7 inclusie te induceren door ISS-N1 of andere regulerende elementen te targeten.
ASO’s kunnen worden ontworpen om bifunctioneel te zijn. Bijvoorbeeld, chimere ASO’s die SR recrutering domeinen (RS peptide) fuseren met een antisense sequentie die silencer motieven onderdrukt is aangetoond dat exon 7 inclusie en SMN eiwit niveaus in patiënt fibroblasten te verhogen; een enkele injectie van de bifunctionele ASO was in staat om SMN eiwit in de hersenen van neonatale muizen te induceren en resulteerde in een verlengde levensduur.65,69 Deze ASO ontwerpstrategie, bekend als ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), werd aanvankelijk nagestreefd in SMA therapeutica, maar latere studies toonden aan dat het RS peptide niet noodzakelijk was om een robuust effect op SMN2 exon 7 inclusie te bereiken. Omdat een chimere aanpak moeilijkheden oplevert bij de productie van de ASO en de cellulaire permeabiliteit van de ASO beperkt, zijn bifunctionele ASO’s niet uitgebreid getest in muizen en worden ze momenteel niet klinisch ontwikkeld.62
Toen eenmaal was aangetoond dat ASO’s gericht tegen ISS-N1 opmerkelijk effectief waren bij het bevorderen van exon 7 inclusie, was de volgende strategische vraag welke ASO-backbone het beste zou worden gebruikt in een potentiële SMA-therapie. De oligonucleotiden waaruit een ASO is opgebouwd worden gewoonlijk aangepast om de farmaceutische eigenschappen zoals cellulaire opname, toxicologie, farmacokinetiek, en doelbinding te optimaliseren. Een gebruikelijke aanpassing, die voortkwam uit een samenwerking tussen Ciba-Geigy Ltd. (nu bekend als Novartis) en Isis Pharmaceuticals (nu bekend als Ionis Pharmaceuticals), is de 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE), die zowel de resistentie van ASO tegen nuclease degradatie als de hybridisatie affiniteit verhoogt.70 2′-MOE oligonucleotiden zijn bewezen zeer veilig te zijn bij knaagdieren en primaten, inclusief mensen.62 Toediening van een 2′-MOE ASO die ISS-N1 blokkeert, verhoogde met succes SMN2 exon 7 in een dosis- en tijdsafhankelijke manier bij SMA muizen, waardoor de neuromusculaire pathologie verbeterde en de overleving drastisch toenam.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals, in samenwerking met Biogen, ontwikkelt een 2′-MOE ASO therapie genaamd nusinersen (ook bekend als IONIS-SMNRx en voorheen ISIS-SMNRx genoemd). Preklinische studies van nusinersen bij niet-menselijke primaten toonden aan dat een enkele intrathecale injectie kon leiden tot de weefselconcentraties die nodig zijn voor significante verbeteringen in exon 7 inclusie en dat deze concentraties gedurende verscheidene maanden gehandhaafd bleven.62 De lange halfwaardetijd van het geneesmiddel betekent dat patiënten mogelijk slechts om de paar maanden een intrathecale injectie nodig hebben.73 In een fase 1 open-labelstudie bij SMA type II/III-patiënten in de leeftijd van 2-14 jaar werd een enkele injectie van nusinersen goed verdragen en lijkt deze bij de hoogste dosering gecorreleerd te zijn met verhoogde HFMSE-scores.74 In juni 2015 maakte Ionis nieuwe gegevens bekend van een lopende open-label fase 2-studie van nusinersen bij type I zuigelingen, waaruit bleek dat de zuigelingen langer leefden en meer motorische mijlpalen bereikten dan wat normaal zou worden verwacht op basis van de natuurlijke geschiedenis van de ziekte.75 Bovendien werd het werkingsmechanisme van het geneesmiddel ondersteund door gegevens die een toename aantoonden van de hoeveelheid full-length SMN2-mRNA en SMN-eiwit in hersen- en ruggenmergweefsels van autopsies van patiënten die de behandeling kregen. Ionis maakte ook gegevens bekend van hun fase 2 open-label uitbreidingsonderzoek bij kinderen met SMA type II/III, waaruit bleek dat 57% van de proefpersonen ten minste een verbetering van drie punten bereikte op de HFMSE en een gemiddelde verbetering van 55 m op de 6-Minute Walk Test (6MWT).76 Fase 3 studies van nusinersen worden momenteel uitgevoerd bij zowel zuigelingen als volwassenen met SMA (NCT02193074; NCT02292537); de resultaten zouden in 2017 beschikbaar moeten zijn.
Hoewel er nog geen veiligheidsproblemen zijn waargenomen met 2′-MOE gebruik in SMA therapie, zijn sommige toxiciteiten geassocieerd met 2′-MOE ASO’s in andere patiëntenpopulaties.77,78 Een andere modificatie van de ruggengraat die wordt onderzocht voor gebruik bij SMA en die deze problemen kan omzeilen zijn fosfoamidaat morfolino oligomeren (PMO’s). Van PMO’s is aangetoond dat ze effectiever zijn dan 2′-MOE in muismodellen van Duchenne spierdystrofie (DMD), een andere pediatrische neuromusculaire ziekte, en ze werden ook goed verdragen door DMD-patiënten.79 Een ICV-injectie van morfolino ASO’s complementair aan ISS-N1 verbeterde de overleving van SMA-muizen aanzienlijk zonder tekenen van toxiciteit voor het centrale zenuwstelsel (CZS).80,81 Een morfolino gericht op ISS-E1, een intronic splicing silencer gevonden upstream van exon 7, verbetert ook het fenotype van SMA muizen.82 Deze aanpak is nog niet genomen in de kliniek.
De backbone chemie van een ASO kan invloed hebben op de geschiktheid voor verschillende toedieningsmethoden, de noodzaak voor herhaalde dosering, en geassocieerde toxiciteit – die allemaal belangrijke implicaties hebben voor het therapeutisch gebruik ervan. Bovendien moet een ASO dat gebruikt wordt voor de behandeling van SMA farmacologisch actief blijven in weefsels van het CZS, met name de motorneuronen. Ongeacht de ruggengraat zal elke ASO die voor de behandeling van SMA is ontworpen waarschijnlijk direct in de cerebrospinale vloeistof moeten worden toegediend via intrathecale injectie. Hoewel sommige studies met perifere toediening van ASO’s bij neonatale muizen werkzaamheid lieten zien, is de bloed-hersenbarrière bij jonge muizen nog niet volledig gevormd en is een perifeer toegediende ASO in staat het CZS te penetreren in een mate die bij mensen niet mogelijk is.71 Bemoedigend is dat intrathecaal geïnjecteerde ASO’s op grote schaal verspreid worden over belangrijke CZS weefsels zoals motorneuronen, astrocyten, en microglia.72,83-Hoewel intrathecale injectie enigszins invasief is en sedatie of anesthesie vereist, hebben ASO’s verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van andere experimentele modaliteiten, waaronder een hoge doelspecificiteit, opmerkelijke werkzaamheid, weinig toxiciteit in vergelijking met systemische toediening van ASO’s, en relatief eenvoudige productieprocessen in vergelijking met biologische geneesmiddelen (maar niet met kleine moleculen). Meer informatie is te vinden in hoofdstuk 18.