Biologische Macromoleculen: Nucleic Acids | National Diagnostics

Nucleic Acids

Zoals vele biologische moleculen zijn nucleïnezuren polymeren, lange moleculen gevormd uit zich herhalende eenheden. Bij nucleïnezuren is de repeterende eenheid de nucleotide. Een nucleotide bestaat uit een vijf koolstofhoudende suiker, een stikstofhoudende base en een fosfaatgroep. De twee voornaamste soorten nucleïnezuren, desoxyribonucleïnezuur (DNA) en ribonucleïnezuur (RNA), bezitten enigszins verschillende suikers in hun respectieve nucleotiden en een verschillende reeks van vier basen die door hun nucleotiden kunnen worden bevat.

DNA Nucleotide
RNA-nucleotide	De structuur van een sectie van een RNA-molecuul.

Zie de aanwezigheid van een hydroxylgroep op de 2′ koolstof van de suiker moety.

DNA en RNA

Adenine – DNA en RNA DNA en RNA	Guanine – DNA en RNA	Thymine – DNA en RNA
Cytosine – DNA en RNA	Cytosine – DNA en RNA	Cytosine DNA en RNA	Uracil – RNA alleen

Van groot belang voor elektroforese is de ionisatie van de fosfaatgroepen, waardoor nucleïnezuren een grote netto negatieve lading krijgen. Omdat elke nucleotide geïoniseerd is, zal de verhouding tussen lading en massa van twee verschillende nucleïnezuurmoleculen zeer dicht bij elkaar liggen.

De fosfaatgroepen van elke nucleotide dragen een negatieve formele lading. Omdat elke nucleotide dezelfde lading draagt, is de verhouding lading/massa van verschillende nucleïnezuurmoleculen bijna identiek. Elektrische kracht zorgt ervoor dat negatief geladen nucleïnezuurmoleculen naar de positieve pool migreren.

DNA en RNA bevatten elk vier mogelijke nucleotiden die overeenkomen met de set van vier mogelijke basen (adenine, guanine, thymine en cytosine voor DNA; adenine, guanine, uracil en cytosine voor RNA). Elke base heeft een bepaalde affiniteit voor één van de andere drie basen, gebaseerd op symmetrieën van waterstofbruggen. De stikstofbasen adenine “basenparen” met thymine (of uracil in RNA). Guanine “basepaart” met cytosine. Door de basenparen kan DNA of RNA bestaan als enkelstrengs of dubbelstrengs variant. De dubbelstrengsvorm bestaat uit twee complementaire strengen die door basenparing aan elkaar zijn gekoppeld.

Door basenparing van twee complementaire strengen kunnen nucleïnezuurmoleculen een dubbelstrengsvorm aannemen.

Basenparing kan ook voorkomen in enkelstrengs DNA of RNA. Een gedeelte dat een sequentie van nucleotiden bevat, zal vaak teruglopen en basenparen met een complementair gedeelte op dezelfde keten. Dit zal de driedimensionale structuur van het molecuul beïnvloeden, met gevolgen voor elektroforetische scheidingen. In het algemeen zullen lange DNA- of RNA-strengen worden aangetroffen in een base-paired conformatie, hetzij dubbelstrengs, hetzij enkelstrengs met interne koppeling. Ongepaarde of “gedenatureerde” nucleïnezuren worden in oplossing alleen aangetroffen onder speciale omstandigheden die de basenparen destabiliseren.

Basenparen is niet beperkt tot dubbelstrengs varianten, maar kan ook binnen hetzelfde molecuul voorkomen. De resulterende conformatie kan leiden tot elektroforeseresultaten die moeilijk te interpreteren zijn.

Elektroforese van dubbelstrengs DNA of RNA wordt natieve gelelektroforese genoemd. Elektroforese van enkelstrengs DNA of RNA vindt plaats onder denaturerende omstandigheden. Formamide en ureum zijn de twee meest gebruikte stoffen voor chemische denaturatie. Deze stoffen verstoren de waterstofbruggen tussen de stikstofbasen, waardoor de effecten van basenparen worden opgeheven. Gewoonlijk wordt een combinatie van formamide, ureum en warmte gebruikt gedurende het hele proces van denaturerende elektroforese, van monstervoorbereiding tot het uitvoeren van de gel. De denatureringscondities zijn bedoeld om ervoor te zorgen dat moleculen uit één streng bestaan en om veranderingen in de conformatie ten gevolge van basenparen tussen verschillende delen van hetzelfde DNA- of RNA-molecuul te voorkomen. Denaturerende elektroforeseomstandigheden zorgen voor een consistente relatie tussen moleculaire grootte en mobiliteit door de gel.

Formamide en ureum bewerkstelligen de denaturatie van DNA of RNA door nieuwe waterstofbruggen te vormen met de basen van de nucleïnezuurmoleculen, waarbij de waterstofbruggen die tot basenparen leiden, worden verbroken.

NAVIG ONDERWIJP: Biologische macromoleculen-Nucleïnezuren