Bookshelf

Specimen Requirements and Procedure

ELISA’s worden uitgevoerd in polystyreenplaten, meestal in 96-wells-platen met een coating om eiwitten zeer sterk te binden. Afhankelijk van het type ELISA zijn voor het testen een primair en/of secundair detectieantilichaam, analyt/antigeen, coatingantilichaam/antigeen, buffer, wassing en substraat/chromogeen nodig. Het primaire detectie-antilichaam is een specifiek antilichaam dat alleen aan het betrokken eiwit bindt, terwijl een secundair detectie-antilichaam een tweede enzymgeconjugeerd antilichaam is dat bindt aan een primair antilichaam dat niet enzymgeconjugeerd is.

Er zijn vier belangrijke algemene stappen voor het voltooien van een ELISA-immunoassay. Deze stappen zijn:

1. Coating (met antigeen of antilichaam)
2. Blocking (gewoonlijk met toevoeging van boviene serumalbumine)
3. Detectie
4. Eindaflezing

Detectie vindt plaats door toevoeging van een substraat dat een kleur kan genereren. Er zijn vele substraten beschikbaar voor gebruik bij ELISA-detectie. De meest gebruikte zijn echter mierikswortelperoxidase (HRP) en alkalische fosfatase (ALP). Het substraat voor HRP is waterstofperoxide en resulteert in een blauwe kleurverandering. ALP meet de gele kleur van nitrofenol na incubatieperioden van 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur en gebruikt gewoonlijk P-Nitrofenyl-fosfaat (pNPP) als substraat.

Tussen elk van de vier bovengenoemde stappen bevindt zich een “wasbeurt” van de plaat met een buffer, zoals met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en een niet-ionisch detergens, om ongebonden materiaal te verwijderen. De putjes worden tijdens elke wasstap twee of meer keren gewassen, afhankelijk van het specifieke protocol dat wordt gevolgd.

In het ELISA-protocol wordt gewoonlijk een seriële verdunning van concentraties in de putjes van de plaat aangebracht. Nadat de resultaten zijn gemeten, wordt een standaardcurve van de seriële verdunningsgegevens uitgezet met een concentratie op de x-as met gebruikmaking van een logschaal en extinctie op de y-as met gebruikmaking van een lineaire schaal.

Er zijn vier hoofdtypen ELISA:

• Directe ELISA (met antigeen beklede plaat; screening antilichaam)
• Indirecte ELISA (met antigeen beklede plaat; screening antigeen/antilichaam)
• Sandwich ELISA (met antilichaam beklede plaat; screening van antigeen)
• Competitieve ELISA (screening van antilichaam)

Directe ELISA

Zowel directe als indirecte ELISA’s beginnen met het aanbrengen van een coating van antigeen op de ELISA-platen. De eerste bindingsstap bestaat uit het toevoegen van antigeen aan de platen, die gedurende één uur bij 37 graden C worden geïncubeerd of ’s nachts bij 4 graden C kunnen worden geïncubeerd. Zodra de incubatie is voltooid, bestaat de volgende stap erin de platen te wassen van eventueel ongebonden antilichaam en ongebonden plaatsen op de ELISA-plaat te blokkeren met middelen als BSA, ovalbumine, aprotinine, of andere dierlijke eiwitten. Deze tweede stap is belangrijk omdat daardoor wordt voorkomen dat niet-specifieke antilichamen zich aan de plaat binden en vals-positieve resultaten tot een minimum worden beperkt. Na toevoeging van de buffer wordt de plaat opnieuw gewassen en wordt een geselecteerd enzymegeconjugeerd primair detectieantilichaam toegevoegd. De plaat wordt verder gedurende een uur geïncubeerd.

In een directe ELISA bindt het primaire detectieantilichaam zich rechtstreeks aan het betrokken eiwit. Vervolgens wordt de plaat opnieuw gewassen om ongebonden antilichaam te verwijderen en gevolgd door de toevoeging van een substraat/chromofoor, zoals alkalische fosfatase (AP) of mierikswortelperoxidase (HRP) aan de plaat, wat resulteert in een kleurverandering. De kleurverandering van het monster vindt plaats door de hydrolyse van fosfaatgroepen van het substraat door AP of door de oxidatie van substraten door HRP. De voordelen van directe ELISA zijn onder andere dat er geen kruisreactiviteit van secundaire antilichamen optreedt en dat deze methode, door het gering aantal stappen, snel is vergeleken met indirecte ELISA. Nadelen zijn de lage gevoeligheid in vergelijking met de andere soorten ELISA’s en de hoge kosten van de reactie.

Indirecte ELISA

De stappen van de indirecte ELISA zijn identiek aan de directe ELISA, met uitzondering van een extra wasstap en de soorten antilichamen die worden toegevoegd nadat de buffer is verwijderd. Voor de indirecte ELISA zijn twee antilichamen nodig, een primair detectieantilichaam dat aan het betrokken eiwit kleeft en een secundair enzymgekoppeld antilichaam dat complementair is aan het primaire antilichaam. Het primaire antilichaam wordt eerst toegevoegd, gevolgd door een wasstap, en vervolgens wordt het enzymegeconjugeerde secundaire antilichaam toegevoegd en geïncubeerd. Daarna zijn de stappen dezelfde als bij de directe ELISA, die een wasstap, de toevoeging van substraat en de detectie van een kleurverandering omvat.

De indirecte ELISA heeft een hogere gevoeligheid in vergelijking met de directe ELISA. Zij is ook minder duur en flexibeler door de vele mogelijke primaire antilichamen die kunnen worden gebruikt. Het enige grote nadeel van dit type ELISA is het risico van kruisreactiviteit tussen de secundaire detectieantilichamen.

Sandwich ELISA

In tegenstelling tot de directe en indirecte ELISA, begint de sandwich ELISA met een vangstantilichaam dat op de wells van de plaat wordt gecoat. Het wordt een “sandwich” genoemd omdat de antigenen ingeklemd zijn tussen twee lagen antilichamen (vang- en detectieantilichamen). Nadat het capture antilichaam aan de platen is toegevoegd, worden de platen afgedekt en ’s nachts bij 4 °C geïncubeerd. Zodra de coatingstap voltooid is, worden de platen gewassen met PBS en vervolgens gebufferd/geblokkeerd met BSA. De bufferwassingen worden gedurende ten minste 1-2 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd. Tenslotte wordt de plaat nogmaals met PBS gewassen voordat het antigeen wordt toegevoegd.

Het antigeen van belang wordt dan aan de platen toegevoegd om zich te binden aan het vangstantilichaam en wordt gedurende 90 min. geïncubeerd bij 37 graden C. De plaat wordt opnieuw gewassen, en het primaire detectieantilichaam wordt dan aan de plaat toegevoegd en nog eens 1 à 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, gevolgd door een bufferwassing. Dan wordt het secundaire enzym-geconjugeerde antilichaam toegevoegd en nog eens 1 à 2 uur geïncubeerd. De plaat wordt opnieuw gewassen en het substraat wordt toegevoegd om een kleurverandering teweeg te brengen. De sandwich-ELISA heeft de hoogste gevoeligheid van alle ELISA-types. De belangrijkste nadelen van dit type ELISA zijn de tijd en de kosten en het noodzakelijke gebruik van “matched pair” (divalent/multivalent antigeen) en secundaire antilichamen.

Competitieve ELISA

De competitieve ELISA test op de aanwezigheid van een antilichaam dat specifiek is voor antigenen in het testserum. Dit type ELISA maakt gebruik van twee specifieke antilichamen, een met een enzym geconjugeerd antilichaam en een ander antilichaam dat in het testserum aanwezig is (indien het serum positief is). Door de twee antilichamen in de putjes te combineren, ontstaat er een competitie voor binding aan het antigeen. De aanwezigheid van een kleurverandering betekent dat de test negatief is omdat het enzymegeconjugeerde antilichaam het antigeen heeft gebonden (niet de antilichamen van het testserum). De afwezigheid van kleur wijst op een positieve test en de aanwezigheid van antilichamen in het testserum. De competitieve ELISA heeft een lage specificiteit en kan niet worden gebruikt in verdunde monsters. De voordelen zijn echter dat er minder monsterzuivering nodig is, dat een groot aantal antigenen in een gegeven monster kan worden gemeten, dat de ELISA kan worden gebruikt voor kleine antigenen, en dat de variabiliteit gering is.