Bulk RNA-seq Data Standards and Processing Pipeline

Pijplijn overzicht

De Bulk RNA-seq pijplijn is ontwikkeld als onderdeel van de ENCODE Uniform Processing Pipelines serie. De volledige pijplijn code is vrij beschikbaar op Github en kan worden uitgevoerd op DNAnexus (link vereist account aanmaken) tegen hun huidige prijzen.

De ENCODE Bulk RNA-seq pijplijn kan worden gebruikt voor zowel gerepliceerde als niet-gerepliceerde, gepaarde of enkelvoudige, en strengspecifieke of niet-strengspecifieke RNA-seq bibliotheken. Bibliotheken moeten worden gegenereerd uit mRNA (poly (A) +, rRNA-verarmd totaal RNA, of poly (A) – populaties die zijn grootte-selected langer te zijn dan ongeveer 200 bp. In de toekomst kan deze pijplijn ook worden gebruikt om PAS-seq en Bru-seq gegevens te verwerken.

Pijplijn Schema voor gepaarde-ended data

Bekijk de huidige instantie van deze pijplijn voor gepaarde-ended data

Pijplijn Schema voor single-ended data

Bekijk de huidige instanties van deze pijplijn voor single-ended data

Inputs:

Bestandsindeling	Informatie in bestand	Bestands beschrijving	Notities
fastq	reads	G-gezipte bulk RNA-seq reads	Reads moeten voldoen aan de criteria zoals uiteengezet in de Uniform Processing Pipeline Restrictions.
tar	genoomindex	Gegenereerd door STAR of TopHat	Zie de paragraaf “Betreffende uitlijning en kwantificering” onder de tabel “Outputs” voor meer informatie over de uitlijners en hun indexen.
fasta	spike-in sequence	ERCC Spike-ins (External RNA Control Consortium)	De spike-ins zijn in feite de controles voor het RNA-seq experiment.

Outputs:

Bestandsindeling	Informatie in bestand	Bestandsbeschrijving	Notities
bam	alignementen	Gemaakt door reads aan het genoom te koppelen.	Zie de paragraaf getiteld “Betreffende alignment en kwantificering” onder de tabel “Outputs” voor meer informatie over de aligners en hun indices.
bam	transcriptoom alignments	Geproduceerd door het in kaart brengen van de gelezen naar het transcriptoom.
bigWig	signal	Genormaliseerd RNA-seq signaal	Voor gestrande data worden signalen gegenereerd voor unieke gelezen en unieke+multimapping gelezen in zowel de plus- als de min-streng. Voor unstranded gegevens, worden signalen gegenereerd voor unieke leest en unieke + multimapping leest zonder inachtneming van streng identiteit.
tsv	genkwantificaties	Inclusief de spike-ins kwantificaties	De specificaties van het bestandsformaat zijn als volgt: kolom 1: gen_id kolom 2: transcript_id(s) kolom 3: length kolom 4: effective_length kolom 5: expected_count kolom 6: TPM (transcripten per miljoen) kolom 7: FPKM (fragmenten per kilobase transcript per miljoen) kolom 8: posterior_mean_count kolom 9: posterior_standard_deviation_of_count kolom 10: pme_TPM kolom 11: pme_FPKM kolom 12: TPM_ci_lower_bound kolom 13: TPM_ci_upper_bound kolom 14: FPKM_ci_lower_bound kolom 15: FPKM_ci_upper_bound
tsv	transcriptkwantificaties	Inclusief de spike-ins kwantificaties	Zie de waarschuwing betreffende transcriptkwantificaties in de onderstaande paragraaf met de titel “Betreffende uitlijning en kwantificering”.
De pijplijn produceert ook kwaliteitsmetriek, waaronder Spearman-correlatie en leesdiepte.

Met betrekking tot uitlijning en kwantificering:

Het in kaart brengen van de gelezen data gebeurt met behulp van het STAR-programma (in sommige gevallen worden zowel STAR als TopHat aligners gebruikt om afzonderlijke bam-bestanden te produceren) en de kwantificering van genen en transcripten gebeurt met het RSEM-programma. Hoewel er algemene overeenstemming tussen de mappings en het gen kwantificaties die door verschillende RNA-seq pijplijnen, kwantificaties van individuele transcript isovormen, die veel complexer, kan sterk verschillen, afhankelijk van de verwerking pijplijn gebruikt en zijn van onbekende nauwkeurigheid. Daarom uitlijningen en gen kwantificaties kunnen vol vertrouwen worden gebruikt, terwijl transcript kwantificaties moeten worden gebruikt met zorg.

Genomic References

Bekijk het genoom referenties en chromosoom maten gebruikt in deze pijplijn

Deze pijplijnen vereisen zowel de assemblage informatie voor de soort van belang en een gen referentie. Elk van de hoofdprogramma’s, TopHat, STAR en RSEM, maakt een index voor gebruik in de volgende stappen. Meer informatie over het gebruik van RSEM is hier beschikbaar.

Exogene RNA spike-in controles

Exogene RNA spike-in controles worden toegevoegd aan monsters tot een standaard basislijn voor de kwantificering van RNA expressie (PMC3166838) te creëren. De ENCODE consortium is standaardiseren op het gebruik van de Ambion Mix 1 commercieel beschikbare spike-ins bij een verdunning van ~ 2% van de uiteindelijke in kaart gebrachte leest. Er is echter een mengsel van oudere gegevens en geïmporteerde gegevens. Daarom, om de spike-ins gebruikt in een bepaalde bibliotheek bij te houden, is er een dataset geassocieerd met de bibliotheek. Die dataset bevat het sequentiebestand van de spike-ins in fasta-formaat en informatie over de concentraties. Deze spike-in sequenties worden verwacht te vinden in het genoom index gebruikt in de mapping stap (s) en in de vervolgens gegenereerde bam. De kwantificaties van de sequenties zijn te vinden in de RSEM transcript en gen kwantificatie bestanden.

Bekijk spike-ins datasets
Bekijk het analysecertificaat voor ERCC spike-ins
Toegang tot het ERCC dash board

Links en Publicaties

Vind data gegenereerd door deze pijplijn: All | paired-end only | single-end only
Verken publicaties (in uitvoering)