Degenerate codon mixing for PCR-based manipulation of highly repetitive sequences

Results and discussion

De ‘autofagic flux’ assay beschreven in Jiang et al. is een kwantitatieve groen fluorescent eiwit (GFP) reporter assay dat de ratiometrische veranderingen van polyQ-GFP naar vrij GFP via Western blot analyse meet. Een multicistronisch reporter construct werd ontworpen om te coderen voor twee eiwitten; polyQ gekoppeld aan N-terminale GFP en vrije GFP. De virale 2A-sequentie (v2A) werd als linker-regio geplaatst tussen de sequenties die coderen voor de twee eiwitten om stoichiometrische translatie van twee afzonderlijke eiwitten uit één open leesframe mogelijk te maken (Fig. 1a).

Wij ontwierpen een polyQ-sequentie met 80 glutamineherhalingen (Q80). De sequentie werd ontworpen om een lage herhaalde overeenkomst te hebben door glutamine-coderende CAG triplets willekeurig te laten overlappen met glutamine-coderende CAA triplets (Fig. 1b, c). De nucleotide substituties werden op het oog gedaan om een semi willekeurig patroon te genereren. Dit niet-repetitieve sequentieontwerp zou niet alleen de stabiliteit van de sequentie tijdens de vermeerdering in bacteriën moeten verbeteren, maar maakte het ook mogelijk PCR-primers te ontwerpen die anneërden op specifieke regio’s van de sequentie.

De Q80-GFP-v2A-GFP construct hierboven beschreven werd commercieel gesynthetiseerd (Biomatik Corporation) (zie Additional file 1) en sub-gecloneerd via de BamHI en ClaI restrictieplaatsen in de Tol2 transposon-gebaseerde, pT2AL200R150G genoverdracht vector (hierna aangeduid als Tol2) verkrijgbaar bij de Kawakami laboratorium (Fig. 1a en zie Additional file 2).

PolyQ constructen met lagere aantallen glutamine herhalingen werden gegenereerd door PCR-gebaseerde uitsluiting amplificatie van de Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP construct. De primers werden ontworpen om te amplificeren rond de vector met uitsluiting van een bepaald aantal glutamine herhalingen om de constructen van belang (Fig. 1d-f) te genereren. Wij streefden naar het genereren van vectoren met ongeveer 52 (Q52), 31 (Q31) en 10 (Q10) glutamine herhalingen. De vermeende Q52 en Q31 vectoren werden gegenereerd met behulp van dezelfde reverse primer gekoppeld aan verschillende forward primers. Deze gemeenschappelijke reverse primer amplificeerde 2 glutamine herhalingen, terwijl de forward primers de extra 50 en 29 glutamine herhalingen amplificeerden die nodig zijn om respectievelijk de Q52 en Q31 vectoren te genereren. De positie van de omgekeerde primer werd iets verschoven om de amplificatie van de vermoedelijke Q10 vector te optimaliseren, zodat de omgekeerde primer nu 5 glutamine herhalingen amplificeerde, terwijl de voorwaartse primer de resterende 5 glutamine herhalingen amplificeerde (Fig. 1d-f). Door strenge annealingtemperaturen in de PCR-reactie te gebruiken, verkregen we specifieke primerbinding. Met gel geëxtraheerde en gezuiverde PCR-producten werden gefosforyleerd, door zelfbinding gecirculeerd en vervolgens in competente cellen getransformeerd (zie Additional file 3). PCR met primers die de polyQ regio flankeerden toonde ongeveer de verwachte productgrootte voor de beoogde putatieve Q52, Q31 en Q10 vectoren (Fig. 1g). De gegenereerde constructen werden gesequeneerd om te bepalen of de verwachte polyQ herhalingsnummers aanwezig waren. Terwijl het Q52-construct het verwachte aantal glutamineherhalingen had (fig. 2a, b), bracht sequencing kleine afwijkingen met de verwachte polyQ-aantallen aan het licht voor de andere twee constructen, waarbij de Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP-vector 21-glutamineherhalingen had (hierna Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP genoemd) (fig. 2c, d) en de Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP-vector (fig. 2b). 2c, d) en de Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP vector had 11-glutamine herhalingen (hierna Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP genoemd) (Fig. 2e, f). Uit verdere analyse bleek dat de gegenereerde Q21-sequentie rechtstreeks was afgeleid van de oorspronkelijke sequentie en dat het verlies van glutamineherhalingen te wijten was aan de Q31-voorwaartse primer die 30 bp stroomafwaarts van de voorspelde bindingsplaats bindt. De extra glutamineherhaling in de Q11-sequentie werd daarentegen de novo gegenereerd, een toevoeging van een CAA-codon.

Om de aggregatiekinetiek en ‘autofagische flux’ van polyQ eiwit in vivo te bestuderen, injecteerden we de gegenereerde polyQ vectoren (25 ng/μL) en transposase mRNA (25 ng/μL) in groepen van één-cel-stadium zebravis embryo’s (Fig. 3a, b). Western blot analyse met anti-GFP antilichaam van 24 uur na de bevruchting (hpf) embryo lysaten (10 embryo’s per monster) werd uitgevoerd voor elke groep. De lege Tol2 vector (25 ng /μL) en transposase mRNA (25 ng /μL) geïnjecteerd en niet-geïnjecteerde embryo’s werden opgenomen als controles. Embryo’s geïnjecteerd met de polyQ constructen geproduceerd twee banden gedetecteerd door de anti-GFP antilichaam zoals verwacht; GFP gehecht aan polyQ (polyQ80-GFP op ~ 48 kDa, polyQ52-GFP op ~ 38 kDa, polyQ21-GFP op ~ 33 kDa en polyQ11-GFP op ~ 31 kDa), en vrije GFP (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Elk van de polyQ-GFP construct tot expressie embryo lysaten toonde ook een zwakkere band van hogere eiwitgrootte die overeenkomt met de volledige lengte polyQX-GFP-v2A-GFP construct (polyQ80-GFP-v2A-GFP op ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP op ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP op ~ 60 kDa, en polyQ11-GFP-v2A-GFP op ~ 58 kDa). Deze band vertegenwoordigt de ~ 10% van het totale eiwit dat wordt vertaald als een enkele, full-length eiwit bij gebruik van de v2A sequentie systeem. De Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP en Q11-GFP:GFP verhoudingen zijn ~ 5, ~ 4, ~ 2 en ~ 1, respectievelijk (Fig. 3d). Aangezien de v2A-sequentie een stoichiometrische vertaling van de polyQ-GFP- en GFP-eiwitten mogelijk maakt, zou de polyQ-GFP:GFP-ratio in theorie 1 moeten zijn. De waargenomen grotere verhoudingen kunnen wijzen op een accumulatie van deze eiwitten. Deze waarnemingen komen overeen met de literatuur, waarin is aangetoond dat polyQ-GFP fusieconstructen met meer dan 19 glutamineresten op een lengte-afhankelijke manier aggregeren binnen getransfecteerde cellen. Deze waarnemingen leiden ons tot de conclusie dat onze Tol2-QX-GFP-v2A-GFP constructen een nuttig instrument om ‘autofagische flux’ te bestuderen in vivo in een larvale zebravis model.

Conclusie

In conclusie deze studie biedt een robuuste en gemakkelijk aan te nemen oplossing voor het genereren van dicht bij de beoogde lengtes van polyQ herhalingen. Om exacte aantallen glutamine herhalingen te genereren kunnen volgende amplificatierondes met gewijzigde primersequenties worden uitgevoerd. Bovendien kan de lengte van de primer worden vergroot om de specificiteit van de annealing van de primer aan het sjabloon te verbeteren. Onze techniek heeft verschillende voordelen ten opzichte van de bestaande methoden voor PCR-gebaseerde amplificatie van repetitieve regio’s en beoogt de minimalisering van de generatie van niet-specifieke PCR-producten en gebrekkige herhalingen door gebruik te maken van de codon-redundantie van de genetische code om een synonieme DNA-coderende sequentie met minder herhalingen te genereren. Bovendien is onze aanpak niet beperkt tot het genereren van polyQ-repeatsequenties, maar kan hij ook worden gegeneraliseerd voor het genereren van andere nucleotide-repeatsequenties. Bovendien is onze methode relatief goedkoop, aangezien alleen voor het initiële polyQ80-GFP-v2A-GFP-construct commerciële synthese nodig is, waarvan de kosten afhangen van de prijs per nucleotide base, lengte, zuiverheid en massa. Alle andere benodigde materialen zijn standaardreagentia die voor moleculaire klonering worden gebruikt. Samenvattend biedt de beschreven techniek een gemakkelijk aan te nemen, betaalbare oplossing voor het genereren van herhalingscoderende DNA-sequenties die naar behoefte kunnen worden gemanipuleerd.