Elucidating the functional role of Mycobacterium smegmatis recX in stress response

Hypoxie veroorzaakt een toename in de expressie van M. smegmatis recA en recX genen

Tijdens de infectie en proliferatie wordt M. tuberculosis blootgesteld aan fysiologische stresscondities zoals hypoxie en zure pH stress, die zijn overleving in gevaar kunnen brengen38,39,40. Acute hypoxische stress stopt bijvoorbeeld de DNA-replicatie en veroorzaakt robuuste DNA-schade41,42,43. Een toename van de expressie van genen van de SOS-route, waaronder umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB, en uvrD, begint bij DNA-schade44,45,46. In dit verband heeft hypoxie-geïnduceerde genexpressie profilering in M. smegmatis en M. tuberculosis tijdens latente infectie waardevolle inzichten opgeleverd over de aard van latente tuberkelbacillen en de behandeling ervan47.

Vorige studies in M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 en Streptomyces lividans50 hebben aangetoond dat recA wordt geco-transcribeerd met recX. Bovendien bleek een overexpressie van RecA (een positieve regulator van de SOS-respons) toxisch te zijn in afwezigheid van RecX in bepaalde bacteriesoorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52, en Xanthomonas oryzae53. Deze bevindingen komen overeen met het idee dat RecX werkt als een anti-recombinase om ongepaste recombinatiegebeurtenissen, bevorderd door RecA14 , te onderdrukken. Daarentegen is de overexpressie van RecA in de E. coli ΔrecX stam niet schadelijk en de deletie van recX heeft geen invloed op de expressie van recA54. De recX-transcriptie in E. coli wordt onder normale groeiomstandigheden gedownreguleerd in vergelijking met recA omdat er een transcriptiebeëindigingsplaats tussen de recA- en recX-coderende sequenties bestaat. Een recA-recX-mRNA-transcript dat het gevolg is van transcriptionele read-through stapelt zich echter op in het bereik van 5-10% van het totale recA-mRNA-gehalte54. Het recX-transcript was nauwelijks detecteerbaar tijdens de vegetatieve groei van E. coli, maar robuuste expressie van recX treedt op na behandeling met DNA-beschadigende agentia15,55.

De genomen van zowel M. smegmatis als M. tuberculosis bevatten elk één kopie van recA en recX in één enkel operon. Om de expressie en regulatie van deze genen onder aërobe en hypoxische groei te onderzoeken in M. smegmatis, een veelgebruikt surrogaatmodel voor M. tuberculosis, werd de relatieve abundantie van mRNA in verschillende groeifasen gemeten met een RT-qPCR assay en genormaliseerd naar dat van het constitutief uitgedrukte 16S rRNA gen. De Ct-waarden (cycle threshold) voor M. smegmatis recA- en recX-mRNA werden genormaliseerd ten opzichte van de Ct-waarde van het 16S rRNA-gen. In tegenstelling tot E. coli15,55 werden significante hoeveelheden recA mRNA transcripten waargenomen in de vroege log fase onder zowel aerobe als hypoxische kweekomstandigheden (Fig. 1A). Interessant is dat hypoxische condities de accumulatie van recA mRNA met 1.5-voudige versterkten in de mid-log fase, en daarna afnamen naarmate de cellen de stationaire fase bereikten. Een soortgelijk patroon werd waargenomen bij de overvloed van recX mRNA onder zowel aerobe als hypoxische condities, zij het op gereduceerde niveaus (Fig. 1B). Deze waarnemingen ondersteunen het idee dat de twee genen samen getranscribeerd worden en gecoördineerd gereguleerd worden onder aerobe en hypoxische groeiomstandigheden. Intrigerend is dat er geen verschil werd waargenomen in de hoeveelheden mRNA onder aërobe en hypoxische groeiomstandigheden in de vroege log-fase. De transcriptionele profielen van M. smegmatis groeifase-specifieke markergenen (sigH2 en sigH7)56 werden gebruikt om de tijdstippen van de early-log, de mid-log en de stationaire fase vast te stellen (Fig. 1C). Bij multiresistente klinische stammen van M. tuberculosis bleken de niveaus van zowel recA- als recX-mRNA hoger te zijn dan bij de drugsvatbare stammen en de niveaus van recX-mRNA stegen gelijktijdig met een stijging van recA-mRNA57.

Echter moet worden opgemerkt dat de mRNA-niveaus niet kunnen worden gebruikt als surrogaat voor de overeenkomstige eiwitniveaus. Daarom werd de overvloed aan RecA- en RecX-eiwitten in M. smegmatis onder aerobe en hypoxische omstandigheden gemeten met behulp van een Western blot-test met anti-RecA- en anti-RecX-antilichamen. GroEL werd onderzocht als controle voor het laden van eiwitten. De densitometrische analyse van immunoblots toonde aan dat de cellen hogere niveaus van RecA accumuleerden onder hypoxische groeicondities dan in aërobe condities (Fig. 2A,B). Een vergelijkende analyse toonde aan dat de cellen consequent 2-maal hogere niveaus van RecA accumuleerden in de mid-log fase ten opzichte van de early-log fase onder aerobe groeicondities, die in de stationaire fase afnamen tot niveaus gezien in de early-log fase (Fig. 2A,B). Een soortgelijk patroon werd waargenomen voor RecX, zij het dat de niveaus minder uitgesproken waren dan die van RecA (Fig. 2A,C). Hoewel de mRNA- en eiwitexpressiepatronen vergelijkbaar waren, werden belangrijke verschillen waargenomen. Ten eerste was het RecX eiwit nauwelijks detecteerbaar in de vroege log-fase tijdens hypoxische condities. Ten tweede was de abundantie van RecA-mRNA en -eiwit hoger in vergelijking met RecX.

Hoewel deze resultaten suggereren dat M. smegmatis recA- en recX-genen induceert onder hypoxische condities, is er geen correlatie tussen de hoeveelheid recX-mRNA en corresponderend eiwit in de vroege log-fase. Van zowel M. tuberculosis als M. smegmatis is aangetoond dat zij hun mRNA-transcripties onder groeiremmende omstandigheden stabiliseren58,59,60. Onder de mogelijke mechanismen is aangetoond dat tRNA-herprogrammering en selectieve codon-gestuurde translatie een rol spelen bij mycobacteriën als reactie op hypoxie61. Een mogelijke verklaring voor het gebrek aan correlatie tussen het recX mRNA- en eiwitniveau in de vroege log-fase zou te wijten kunnen zijn aan translationele repressie van recX mRNA.

Bouw van ΔrecX en ΔrecA ΔrecX mutantstammen

Het verschil in de RecA- en RecX-eiwitniveaus in M. smegmatis wijst op een mogelijke regulatie van de genexpressie op het niveau van de transcriptie. In veel tot nu toe bestudeerde bacteriën bevindt het recX-gen zich op dezelfde coderende streng stroomafwaarts van recA en worden de twee genen samen getranscribeerd48,50,53,54,62,63. In de lexA-recA-recX locus van Xanthomonas pathovars komt elk gen echter tot expressie via zijn eigen promotor64. Verder zijn in D. radiodurans65,66, B. subtilis67 en N. gonorrhoeae26 de recA- en recX-genen enkele honderden kb lang van elkaar gescheiden en worden ze door hun eigen promotors getranscribeerd.

In een aantal mycobacteriële soorten, evenals in enkele andere bacteriën, overlapt de 5′-regio van de recX-coderende sequentie de 3′-regio van het recA-gen. De overlapping is 32 bp lang in M. smegmatis48 , terwijl in M. tuberculosis68 en M. leprae69 de overlapping 35 bp bedraagt. Het effect van recX deletie op de fenotypische kenmerken is in verschillende organismen bestudeerd7,10. De knockout-mutanten van recX vertonen een reeks fenotypen die met RecA-functies verband houden: de inactivering van recX bij B. subtilis maakte de cellen gevoelig voor MMS en H2O225, de recX-mutanten bij S. lividans vertoonden een verminderde weerstand tegen UV-schade42 en de recX-mutant bij N. gonorrhoeae vertoonde een geringe afname van zijn vermogen om DNA-schade door dubbelstrengsbreuken te overleven26. Het effect van deletie van zowel recA- als recX-genen op de groeikenmerken en het herstel van DNA-schade is echter bij geen enkel organisme onderzocht. Bovendien is een volledig begrip van de in vivo rol van recX in mycobacteriën nog niet begrepen.

Vorige studies hebben aangetoond dat de M. smegmatis ΔrecA stam gevoeligheid vertoont voor UV-geïnduceerde DNA schade en er niet in slaagt HR52 te bevorderen. Wij combineerden de recA mutatie met de deletie van recX om de effecten van de dubbele mutaties te onderzoeken. Daartoe werden M. smegmatis mc2155 recX enkelvoudige en recArecX dubbelmutantstammen gegenereerd. Als controle werd het effect van recA deletie in M. smegmatis opnieuw geëvalueerd voor een directe vergelijking. Met behulp van de recombineering-methode, die gebaseerd is op een protocol dat ontwikkeld is voor M. tuberculosis en M. bovis BCG28, werden de M. smegmatis mc2155 ΔrecA- en ΔrecAΔrecX-mutanten gegenereerd met behulp van respectievelijk 3,279 kb en 3,302 kb lineaire ΔrecA::hyg- en ΔrecAΔrecX::hyg AES constructen. Ongeveer 100 ng van lineaire AES DNA-fragmenten werden gegenereerd door restrictie digestie van de respectieve plasmiden met EcoRV (Fig. 3A). Deze werden getransformeerd in bevoegde M. smegmatis mc2155:pJV53 recombineering cellen70. Na 4-5 dagen incubatie werden voor de ΔrecX- en ΔrecAΔrecX-mutanten 8-10 hygiënesistente kolonies gevonden. De vermeende mutantstammen werden gescreend met behulp van PCR om te bepalen of de recX- en recArecX-genen van het chromosoom waren verwijderd (gegevens niet weergegeven). De correcte mutanten werden gedurende 5-8 generaties gekweekt in 7H10 Middlebrook agar medium om het verlies van pJV53 mogelijk te maken.

Genotypische en fenotypische analyse van M. smegmatis ΔrecX en ΔrecAΔrecX mutanten

Na screening door PCR werden telkens 2 van de ΔrecX en ΔrecAΔrecX knock-out mutanten van M. smegmatis mc2155 verkregen. De ΔrecX en ΔrecAΔrecX mutanten werden gekarakteriseerd door restrictie-enzym mapping en Southern blot hybridisatie (Fig. 3). Na hybridisatie met geschikte radioactief gemerkte probes werd een fragment van 4,1 kb gezien in het geval van de wild-type M. smegmatis mc2155-cellen. De voorspelde 3,14 kb en 2,09 kb fragmenten werden waargenomen in respectievelijk de ΔrecX en ΔrecAΔrecX mutanten (Fig. 3B,C). Beide banden zijn kleiner dan 4,1 kb, wat erop wijst dat de recX- en recArecX-genen door allelvervanging zijn verwijderd. De frequentie van allelische verwisseling met betrekking tot recX en recArecX bedroeg respectievelijk 70% en 80%.

Een voorbehoud bij deze analyse is dat de waargenomen effecten van ΔrecX en ΔrecAΔrecX mutaties het gevolg kunnen zijn van de polaire effecten van de insertie van het hygromycine-resistentiegen. In het algemeen zouden genetische wijzigingen rond de recA-recX locus kunnen leiden tot polaire effecten op de expressie van genen stroomafwaarts van de recA-recX locus. Twee onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd om de mogelijke polaire effecten te onderzoeken. Eerst werden de ΔrecX en ΔrecAΔrecX mutanten gecomplementeerd met de functionele kopieën van de recA en recX genen. De transformanten werden geëvalueerd op hun vermogen om te groeien in een standaard kweekmedium en de mutantcellen te beschermen tegen UV-straling. Tienvoudige seriële verdunningen werden op 7H10 agarplaten gespot en geanalyseerd. Zoals blijkt uit Fig. 4A,B, complementeerde de wild-type recA gedeeltelijk de ΔrecA en ΔrecAΔrecX mutantstammen, zoals blijkt uit hun vermogen om groei te ondersteunen en bescherming te bieden tegen UV-straling. Wild-type recX kon het fenotype van ΔrecAΔrecX mutantstammen, dat werd waargenomen bij inductie van DNA-schade met UV-straling, echter niet redden. Aangezien de schrapping van recX geen merkbaar effect had op de groei onder normale en DNA-beschadigende omstandigheden, vertoonden ΔrecX en de overeenkomstige gecomplementeerde stam een vergelijkbare groei als die van het wild-type.

Ten tweede hebben we de expressie beoordeeld van twee M. smegmatis mc2155 genen, gluD (MSMEG_2725) en glnH (MSMEG_2726), die zich stroomafwaarts van de recA-recX locus bevinden in de ΔrecA ΔrecX en ΔrecX mutantstammen in vergelijking met de wild-type stam. Het M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) gen dat zich stroomopwaarts van de recA-recX locus bevindt, werd als positieve controle gebruikt. Het totale RNA werd bereid uit de wild-type, ΔrecA ΔrecX en ΔrecX mutantstammen. De relatieve abundanties van de gen-transcripten werden bepaald door kwantitatieve RT-qPCR en genormaliseerd naar die van het constitutief uitgedrukte chromosomale 16S rRNA-gen. De expressieniveaus werden gemeten van cellen die in de late exponentiële groeifase waren gegroeid. In alle gevallen waren de genexpressieprofielen van zowel de stroomopwaartse als stroomafwaartse ORF’s vergelijkbaar voor de wild-type en mutant stammen (Fig. 4C). Alles bij elkaar sluiten deze resultaten de mogelijkheid uit dat insertie van het hygromycine-resistentiegen polaire effecten veroorzaakt.

De M. smegmatis ΔrecA en ΔrecA ΔrecX mutantstammen vertonen een verminderde groei en verminderde celopbrengst ten opzichte van de wild-type stam

Om de M. smegmatis ΔrecX en ΔrecA ΔrecX mutantstammen te karakteriseren, werden de groeiprofielen van de wild-type en knock-out stammen gemeten in 7H9 Middlebrook bouillon bij 37 °C (Fig. 5). De recX deletie had geen waarneembaar effect (vergeleken met de wild-type stam) op de groei van M. smegmatis. Onder vergelijkbare omstandigheden deed recA-deletie de lengte van de lag-fase duidelijk toenemen en tegelijkertijd de exponentiële groeifase afnemen, wat suggereert dat recA een rol speelt in de groei en levensvatbaarheid van M. smegmatis. Bovendien zijn deze resultaten consistent met de bekende functie van RecA in de redding van afgebroken of ingestorte replicatievorken71,72,73. Omdat de recA- en recX-genen één operon vormen, werd de impact van hun deletie op de groei van M. smegmatis onderzocht. De ΔrecA ΔrecX knock-outstam vertoonde een groeifenotype dat het midden hield tussen de ΔrecA mutant en de wild-type stam; de groei in de late log- en stationaire fasen was echter vergelijkbaar met die van ΔrecA en de wild-type stammen.

Deletie van recA, maar niet van recX, maakt M. smegmatis gevoeliger voor DNA-beschadigende agentia

Net als bij andere eubacteriën speelt het mycobacteriële RecA-eiwit een cruciale rol in de regulering van de SOS-respons bij DNA-beschadiging74,75,76,77. Om te testen of de afwezigheid van recArecX en recX invloed heeft op het vermogen van M. smegmatis om beschadigd DNA effectief te repareren, werden de mutanten blootgesteld aan een reeks agentia met uiteenlopende mechanismen van DNA-schade. In deze experimenten werd stress geïnduceerd door de ΔrecA, ΔrecX en ΔrecA ΔrecX mutantstammen bloot te stellen aan UV-straling, MMS, H2O2 of ciprofloxacine tijdens de exponentiële fase (OD600 van 0,6) van de bacteriële groei. Na 3 uur incubatie werden de cellen gewassen en werd hun levensvatbaarheid bepaald door tienvoudige seriële verdunningen van de culturen te spotten op Middlebrook 7H10 agarplaten met hygromycine (100 µg/ml). De meest geschikte concentratie/dosis van de DNA-beschadigende middelen werd bepaald na evaluatie van de verschillen in levensvatbaarheid van de cellen tussen de stammen met behulp van plaattests. In afwezigheid van DNA-beschadigende middelen vertoonden alle stammen een vergelijkbaar niveau van levensvatbaarheid van de cellen (fig. 6). In aanwezigheid van DNA-beschadigende middelen vertoonde de ΔrecA-stam daarentegen een uitgesproken groeivertraging die gepaard ging met een 100-voudige daling van de uitplatingsefficiëntie ten opzichte van de wild-type stam. Dit fenotype is in overeenstemming met de beschikbare literatuur. Daarentegen werd het dodelijke effect van UV, MMS of ciprofloxacine, maar niet van H2O2, gedeeltelijk geblokkeerd door deletie van het recX-gen in de ΔrecA-stam. Hoewel de reden voor het ontbreken van het H2O2-effect niet duidelijk is, was de gebruikte concentratie waarschijnlijk niet hoog genoeg om de groei te beïnvloeden. Interessant is dat de ΔrecX-stam een iets resistenter fenotype vertoonde tegen alle vier de DNA-beschadigende agentia dan de ΔrecA ΔrecX-stam, wat wijst op een mogelijke “gain-of-function” als gevolg van het verlies van het recX-gen. Gezien deze resultaten is het duidelijk dat recA een actieve rol speelt in de SOS-respons en dat de gevoeligheid voor DNA-beschadigende agentia licht onderdrukt wordt in ΔrecX-stam.

Overleving na behandeling met verschillende concentraties van DNA-beschadigende agentia

Mycobacteriën ervaren een aantal ongunstige stressomstandigheden, zoals oxidatieve, voedings- en door geneesmiddelen veroorzaakte stress78,79,80,81,82. Om de verschillen in levensvatbaarheid van de cellen verder te onderzoeken, werden experimenten uitgevoerd waarbij de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten aan de hand van kolonievormende eenheden (CFU’s). Eerst werd de levensvatbaarheid van M. smegmatis mc2155 ΔrecA-, ΔrecX- en ΔrecAΔrecX-mutanten getest in vergelijking met die van het wild-type door ze met toenemende concentraties MMS uit te dagen. De stammen werden gekweekt in aanwezigheid van de aangegeven concentraties MMS, tot de culturen een OD600 van 0,6 bereikten. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door het uitplaten van een vooraf bepaald aantal cellen op 7H10 agarplaten. De cellen werden levend bevonden als zij zich konden delen en kolonies konden vormen. De mutanten vertoonden, in tegenstelling tot de wild-type stam, een verhoogde gevoeligheid voor MMS op een concentratie-afhankelijke wijze. Uit de kwantitatieve analyse bleek dat de ΔrecA-mutant een relatief hogere gevoeligheid voor MMS vertoonde, die toenam met toenemende concentraties MMS (Fig. 7A). In het geval van ΔrecX waren de cellen ~ 2-maal minder gevoelig voor MMS in vergelijking met de ΔrecA-cellen. Anderzijds vertoonde de ΔrecA ΔrecX mutant een grotere gevoeligheid voor MMS in tegenstelling tot de ΔrecX mutant. De gevoeligheid van de ΔrecX mutant voor MMS wijst erop dat recX naast RecA mogelijk nog niet geïdentificeerde doelwitten heeft. Deze veronderstelling moet verder worden onderzocht.

Verder werden de gevoeligheden van de M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX en ΔrecA ΔrecX mutantstammen ten opzichte van de wild-type stam bepaald door ze bloot te stellen aan toenemende concentraties H2O2. De resultaten tonen aan dat de ΔrecA-mutant minder gevoelig was voor deze behandeling (Fig. 7B). De deletie van recX alleen, of de deletie van de recA-recX locus, had slechts een gering effect op de levensvatbaarheid en de proliferatie van de mutantcellen in reactie op de behandeling met H2O2. Met name de ΔrecA en ΔrecAΔrecX mutantstammen vertoonden een gevoelig groeifenotype voor UV-straling en ciprofloxacine dat aanzienlijk veel ernstiger is dan voor MMS of H2O2 (Fig. 7C,D). Bovendien vertoonde de ΔrecA-stam een grotere gevoeligheid voor UV-straling en ciprofloxacine dan de ΔrecA ΔrecX dubbelmutantstam.

De expressie van recA- en recX-genen wordt geïnduceerd door DNA-schade

De regulerende elementen stroomopwaarts van het recA-gen zijn niet bij alle mycobacteriële soorten geconserveerd. Het recA-gen van M. tuberculosis bijvoorbeeld wordt getranscribeerd vanuit twee promotors: beide zijn DNA-beschadigingsinduceerbaar, zij het via verschillende mechanismen. De promotor P1 van M. tuberculosis recA (proximaal van het startcodon) kan worden geïnduceerd na DNA-schade, onafhankelijk van de LexA- en RecA-eiwitten. De promoter P2 (op afstand van het recA-startcodon) wordt daarentegen gereguleerd door LexA, die functioneel analoog is aan de recA-promotor van E. coli83,84,85. Interessant is dat het mechanisme van DNA-schade-inductie in M. tuberculosis niet volledig geconserveerd is in M. smegmatis46,75. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om de expressie en regulatie van de M. smegmatis recA en recX genen en hun rol in reactie op DNA-beschadigende agentia te begrijpen.

Zoals hierboven beschreven, veroorzaakte hypoxie een toename in de expressie van M. smegmatis recA en recX genen (Fig. 1). Om verder te bevestigen dat de expressie van M. smegmatis recA en recX genen schade-induceerbaar is, werd de kinetiek van inductie met en zonder DNA schade bepaald met behulp van RT-qPCR. Er werden totale RNA-monsters bereid van M. smegmatis-cellen die 0, 3, 6, 9 en 12 uur na blootstelling aan UV-licht werden geoogst, alsmede van onbehandelde culturen, en deze werden geanalyseerd zoals beschreven in de sectie Methoden. De resultaten toonden geen significante verschillen tussen de recA- en recX-transcriptieniveaus in onbehandelde cellen. Daarentegen werd een duidelijke toename van de recA- en recX-mRNA-transcripten waargenomen 3 uur na blootstelling aan UV-straling, en daarna een lichte afname. Een vergelijking van de RT-qPCR gegevens wijst op belangrijke verschillen tussen de recA en recX transcript niveaus. Blootstelling aan UV-straling leidde tot een ~8-voudige toename van recA mRNA ten opzichte van de controle, terwijl recX met ~3-voudige toenam (Fig. 8A,B). Hoewel recA- en recX-mRNA dus in dezelfde transcriptionele eenheid voorkomen, ondersteunen deze resultaten het idee dat de productie en/of stabiliteit van recX-mRNA-transcript onderworpen is aan een bijkomend posttranscriptioneel reguleringsmechanisme.

Deze resultaten leidden ons tot het uitvoeren van aanvullende experimenten om de kinetiek van de accumulatie van RecA- en RecX-eiwitten in M. smegmatis-cellen met of zonder DNA-beschadiging te bepalen. Western blotting assays werden uitgevoerd op hele cellysaten met behulp van polyklonale antilichamen tegen RecA en RecX (Fig. 8C). De kwantificering van Western blots toonde aan dat de cellen aanzienlijke hoeveelheden van zowel RecA als RecX eiwitten bevatten in niet-geïnduceerde cellen (Fig. 8D,E). Ter vergelijking, een 2-voudige toename in de overvloed van zowel RecA als RecX (boven controle) werd gezien in cellen 3 uur na blootstelling aan UV-straling en nam daarna af. Belangrijk is dat de inductie van RecA- en RecX-eiwitten een patroon vertoonde dat doet denken aan dat in cellen onder hypoxische omstandigheden (Fig. 2), hoewel de mechanismen waarmee zij DNA beschadigen waarschijnlijk verschillend zijn.

Slotopmerkingen

Er zijn talrijke studies die hebben aangetoond dat recA en recX een breed scala van functies uitvoeren die verband houden met DNA-reparatie en recombinatie7,10. Voor zover wij weten, zijn de stimuli die de expressie van M. smegmatis recA en recX genen activeren niet geïdentificeerd. In deze studie werden de expressieniveaus van deze genen beoordeeld in cellen bij aërobe groei en in reactie op verschillende stresscondities. Bij M. smegmatis behoren recA en recX, zoals bij vele bacteriesoorten, tot hetzelfde operon, en het recX-gen bevindt zich onmiddellijk stroomafwaarts van het recA-gen, en heeft overlappende coderingsgebieden86. Er werd vastgesteld dat DNA-beschadigende agentia de expressie van beide genen in verschillende mate induceren; de expressieverhoudingen volgen echter een vergelijkbaar patroon. Interessant is dat de niveaus van zowel RecA als RecX hoog blijven onder stressomstandigheden in vergelijking met aerobe groeiomstandigheden.

Verschillende studies hebben alternatieve rollen voor recX aangetoond bij recombinationeel DNA-herstel dat wordt bevorderd door RecA. Terwijl RecX eiwit fysiek interageert met RecA, en functioneert als een krachtige remmer van alle bekende functies van de laatste in veel bacteriële soorten14,46,48, versterkt het homologe recombinatie in N. gonorrhoeae en B. subtilis25,26. Om inzicht te krijgen in de rol van recX in de stressrespons bij mycobacteriën, werden knock-out mutanten van M. smegmatis recX en recArecX geconstrueerd. Interessant is dat de deletie van recX in M. smegmatis resulteerde in een iets resistenter fenotype tegen alle vier de DNA-beschadigende agentia, wat wijst op een mogelijke “gain-of-function” ten gevolge van het verlies van het recX-gen. De moleculaire basis van dit effect is niet duidelijk, wat de moeite waard lijkt om in toekomstige studies te onderzoeken. Hoewel onze analyse vooral gericht was op de genetische interactie tussen recA en recX in de recombinatie DNA reparatie pathway, lijkt recX interessant genoeg een belangrijke rol te spelen in de groei van bacteriën. Samenvattend zijn deze bevindingen consistent met het idee dat M. smegmatis recX een belangrijke rol speelt in DNA reparatie/recombinatie processen onder ongunstige omstandigheden, misschien door het reguleren van de nadelige effecten van een subset van de nog onbekende genen.

Gebruikte afkortingen zijn

DTT, dithiothreitol; EDTA, ethyleendiamine tetraazijnzuur; kb, kilobase; MMS, methylmethaansulfonaat; ODN, oligonucleotide; PAGE, polyacrylamide gelelektroforese; PVDF, polyvinylideendifluoride membraan; RT-qPCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reaction; SDS, natriumdodecylsulfaat; ssDNA, enkelstrengs DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M natriumcitraat (pH 7,0) buffer.