Endotoxine detectie – van limulus amebocyte lysaat tot recombinant factor C

Gram-negatief bacterieel endotoxine is een biologisch pyrogeen dat koorts veroorzaakt bij intraveneuze toediening. Het endotoxine, ook bekend als lipopolysaccharide (LPS), wordt aangetroffen in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën. Tijdens Gram-negatieve sepsis stimuleert endotoxine de gastheermacrofagen om ontstekingsbevorderende cytokinen vrij te geven. Overmatige ontsteking veroorzaakt echter meervoudig orgaanfalen en de dood. Endotoxinen, alomtegenwoordige pathogene moleculen, zijn een plaag voor de farmaceutische industrie en de gezondheidszorg. Vroege en gevoelige detectie van endotoxine is dus van cruciaal belang om endotoxemie te voorkomen. Het limulus amebocyte lysate (LAL) wordt al ~30 jaar op grote schaal gebruikt voor de detectie van endotoxine bij de kwaliteitsborging van injecteerbare geneesmiddelen en medische hulpmiddelen. Het LAL vormt een cascade van serineproteasen die door sporen endotoxine in werking worden gesteld en aan het eind van de reactie in een gelklonter uitmonden. Factor C, die normaal als zymogeen bestaat, is de primer van deze stollingscascade. In vivo is Factor C de perfecte biosensor, die de degenkrab waarschuwt voor de aanwezigheid van een Gram-negatieve indringer. Het hemostatische eindpunt sluit de indringer in, waardoor deze wordt gedood en verdere infectie wordt beperkt. Als in vitro detectie-instrument voor endotoxine vormen variaties in de gevoeligheid en specificiteit van LAL voor endotoxine en het slinkende aanbod van de hoefijzerkrab echter steeds grotere uitdagingen voor de biotechnologische industrie. Dit heeft de innovatie van een alternatieve test voor endotoxine noodzakelijk gemaakt. Zo werd Factor C het voor de hand liggende, zij het lastige doelwit voor de inspanning op het gebied van recombinante technologie. Dit hoofdstuk beschrijft de weg van het ontginnen van het natuurlijke bloedlysaat van de bedreigde diersoort tot de monumentale inspanning van genetische manipulatie, om recombinant Factor C (rFC) te produceren. De rFC is een 132 kDa-molecule, die werd geproduceerd als een pro-enzym dat induceerbaar is door de aanwezigheid van sporen van endotoxine. De rFC vormt de basis van de “PyroGene”-kit, een nieuwe micro- enzymatische endotoxinediagnostische assay voor high-throughput screening van endotoxine. Met behulp van de rFC heeft Lonza Inc. de “PyroSense” voortgebracht, die als controlepunt van de biotechnologische productielijn fungeert. Zo heeft de rFC, van klonen tot commerciële toepassingen, een nieuw tijdperk ingeluid in endotoxine-testen voor de kwaliteitsborging van biomedische producten en voor de gezondheidszorgindustrie, waarbij de bedreigde degenkrabben worden ontzien.