Extrinsieke versus intrinsieke apoptose pathways in antikanker chemotherapie

Signalering via de intrinsieke pathway van apoptose

In de mitochondriale pathway van apoptose, is activering van caspase nauw verbonden met permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan door proapoptotische leden van de Bcl-familie (Green en Kroemer, 2004). Talrijke cytotoxische stimuli en proapoptotische signaaltransducerende moleculen convergeren op mitochondriën om permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan te induceren (Decaudin et al., 1998; Green en Kroemer, 2004). Deze permeabilisatie wordt gereguleerd door eiwitten van de Bcl-2 familie, mitochondriale lipiden, eiwitten die de bio-energetische metaboliet flux reguleren en componenten van de permeabiliteit overgangsporie (Green en Kroemer, 2004). Bij de verstoring van de buitenste mitochondriale membraan komt een reeks eiwitten vrij die zich normaal in de ruimte tussen de binnenste en buitenste mitochondriale membranen bevinden, waaronder cytochroom c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF en endonuclease G (Saelens et al., 2004). Eenmaal in het cytosol brengen deze apoptogene eiwitten de uitvoering van de celdood op gang door de activering van caspase te bevorderen of door te fungeren als caspase-onafhankelijke doodseffectoren (Saelens et al, 2004).

Mitochondriale mediatoren van caspase-afhankelijke apoptose

Cytochroom c

Het vrijkomen van cytochroom c uit mitochondriën activeert direct caspase-3 door vorming van het cytochroom c/Apaf-1/caspase-9-bevattende apoptosoomcomplex (Cain et al., 2000). Eenmaal in het cytosol bindt cytochroom c aan de C-terminale regio van Apaf-1, een cytosolisch eiwit met een N-terminaal caspase-recruitment domein (CARD), een nucleotide-bindend domein met homologie aan Caenorhabditis elegans CED-4 en een C-terminaal domein dat 12-13 WD-40 herhalingen bevat (Zou et al., 1997). Binding van cytochroom c aan Apaf-1 vergemakkelijkt de associatie van dATP met Apaf-1 en legt de N-terminale CARD bloot, die nu kan oligomeriseren en een platform kan worden waarop de initiator caspase-9 wordt gerekruteerd en geactiveerd door een CARD-CARD interactie (Adrain et al., 1999). Vervolgens wordt de beul caspase-3 gerekruteerd naar het apoptosoom, waar het wordt geactiveerd door de inwonende caspase-9 (Bratton et al., 2001). Caspase-3 klieft vervolgens belangrijke substraten in de cel om veel van de cellulaire en biochemische gebeurtenissen van apoptose te produceren.

In bepaalde gevallen draagt caspase-activiteit, geïnitieerd door cytosolisch cytochroom c, bij tot de daling van matrix metalloproteinase (MMP), zoals werd aangetoond door het gebruik van synthetische caspaseremmers en Apaf1 -/- cellen (Waterhouse et al., 2001). Bovendien tast de caspaseactiviteit de functie van gepermeabiliseerde mitochondriën verder aan door de activiteit van complexen I en II te beïnvloeden, wat onvermijdelijk leidt tot het verlies van MMP en de generatie van reactieve zuurstofspecies (Ricci et al., 2004). Secundaire gebeurtenissen als gevolg van cytosolische veranderingen, veroorzaakt door het vrijkomen van cytochroom c en andere mitochondriale IMS-eiwitten, kunnen dus terugkoppelen naar gepermeabiliseerde mitochondriën en hun functie beïnvloeden. Belangrijk is dat deze mitochondriale amplificatielus van caspase-activiteit kritisch de respons van kankercellen op cytotoxische behandelingen kan bepalen.

Daarnaast is er recent bewijs voor het bestaan van een cytochroom c- en apoptosoom-onafhankelijk, maar Apaf-1-afhankelijk mechanisme(n) voor caspase-activatie. Een gerichte knock-in van een variant van cytochroom c die geen apoptogene eigenschappen heeft, maar wel elektronenoverdracht en antioxidant activiteit (K72A), maakte het mogelijk de bijdrage van cytochroom c aan apoptose te evalueren zonder zijn functie in oxidatieve fosforylering aan te tasten (Hao et al., 2005). Interessant is dat thymocyten van de KA/KA muizen duidelijk gevoeliger waren voor doodsstimuli, waaronder etoposide en γ-bestraling, dan Apaf-1(-/-) thymocyten (Hao et al., 2005). Na behandeling met γ-bestraling werden procaspasen efficiënt geactiveerd in apoptotische KA/KA thymocyten, maar oligomerisatie van Apaf-1 werd niet waargenomen (Hao et al, 2005), wat wijst op een verschillend vereiste voor cytochroom c en Apaf-1 in apoptose.

Smac/DIABLO

Andere eiwitten die vrijkomen uit mitochondria, zoals Smac/DIABLO en Omi/HtrA2, vergemakkelijken de activering van caspases door het neutraliseren van endogene remmers van caspases, de inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Smac en zijn muizenhomoloog DIABLO zijn nucleair gecodeerde mitochondriale eiwitten, die een mitochondriaal lokalisatiesignaal bevatten, dat proteolytisch wordt verwijderd bij mitochondriale import om het rijpe 23 kDa eiwit te verkrijgen (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Door deze rijpingsstap komt het IAP-bindende motief (IBM) aan de N-terminus van Smac/DIABLO bloot te liggen (Du et al., 2000) (Tabel 1). Van de tweede uit de mitochondriën afgeleide activator van caspase/DIABLO werd aangetoond dat hij op een BIR-afhankelijke manier bindt aan XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin en Apollon (Vaux en Silke, 2003) (figuur 2), en werkt als homodimeer waarbij de IBM in een bivalente configuratie aanwezig is (Chai et al., 2000). Eén Smac/DIABLO-dimeer bindt één XIAP-molecuul door beide IAP-bindende motieven, waarbij de ene interageert met BIR2 en de andere met BIR3 (Huang et al., 2003). Intrigerend is dat dezelfde BIR3-groef bindt aan de IBM die blootligt aan de N-terminus (Ala-Thr-Pro-Phe) van de kleine subeenheid van caspase-9 na diens autokatalytische verwerking na Asp315, waardoor Smac/DIABLO caspase-9 kan verdringen van XIAP (Srinivasula et al., 2001) (tabel 1).

De fysiologische mitochondriale functie van Smac/DIABLO is onbekend, en DIABLO -/- muizen lijken normaal (Okada et al., 2002). Hoewel de in vitro splitsing van procaspase-3 na toevoeging van cytochroom c werd geremd in lysaten van Smac -/- cellen, reageerden Smac -/- muizen en cellen normaal op apoptotische stimuli zoals UV-straling, staurosporine, etoposide en TNF/cyclohexamide (Okada et al., 2002). Deze observaties suggereren het bestaan van redundante factoren die het verlies van Smac/DIABLO compenseren, mogelijk HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 is een nucleair gecodeerd, 49 kDa eiwit met een N-terminaal mitochondriaal lokalisatiesignaal dat zijn translocatie in de mitochondriale intermembraanruimte medieert (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 wordt in de intermembrane ruimte verwerkt tot de 37 kDa rijpe vorm, waarbij een IBM vrijkomt aan zijn N-terminus (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabel 1). Hoewel recombinant Omi/HtrA2 zijn eigen maturatie in vitro kan katalyseren, blijft het protease dat verantwoordelijk is voor zijn maturatie in cellen onbekend (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 speelt een essentiële rol in de regulering van de mitochondriale homeostase, waarvoor zijn proteolytische activiteit vereist is, hoewel de moleculaire doelwitten en interactiepartners van Omi/HtrA2 in het mitochondrium nog niet zijn gedefinieerd (Saelens et al., 2004). Zodra Omi/HtrA2 uit de mitochondriën vrijkomt in het cytosol, bevordert het de celdood op een caspase-afhankelijke manier door het tegenwerken van IAP’s, en op een caspase-onafhankelijke manier als een protease (Saelens et al., 2004). Net als Smac/DIABLO blokkeert Omi/HtrA2 IAP’s via zijn N-terminale IAP-bindende motief, dat in een trimerische configuratie aanwezig is (Li et al, 2002)

Hoewel het vrijkomen van cytochroom c in het cytosol direct caspase-3 activering in gang zet door vorming van het cytochroom c/Apaf-1/caspase-9-bevattende apoptosoom complex, bevorderen Smac/DIABLO en Omi/HtrA2 indirect caspase activering door het tegengaan van de remmende effecten op IAPs (Saelens et al., 2004). Er bestaat dus een dynamisch evenwicht tussen pro- en anti-apoptotische effectormoleculen, waardoor de cel het hoofd kan bieden aan beperkte mitochondriale schade, in welk geval IAPs caspase-activering, geïnitieerd door een kleine hoeveelheid vrijgekomen cytochroom c, adequaat kunnen blokkeren. Onder omstandigheden echter waarin mitochondriale schade optreedt of tegelijkertijd meerdere mitochondriën treft, kan de anti-apoptotische hindernis die IAP’s opwerpen worden overwonnen door de hogere cytosolische concentratie van hun antagonisten Smac/DIABLO en HtrA2/OMI, die IAP’s neutraliseren door directe binding.

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat kankercellen een intrinsieke drang tot apoptose hebben die door IAP’s in toom wordt gehouden. In dit verband werden hoge basale niveaus van caspase-3- en caspase-8-activiteiten en actieve caspase-3-fragmenten in afwezigheid van apoptose gedetecteerd in verschillende tumorcellijnen en kankerweefsels, maar niet in normale cellen (Yang et al., 2003a). Tumorcellen, maar niet normale cellen, brachten ook hoge niveaus van IAPs tot expressie, wat suggereert dat de verhoogde IAP expressie de hoge basale caspase activiteit selectief tegenging in tumorcellen (Yang et al., 2003a). Daarom worden strategieën gericht op IAPs beschouwd als een veelbelovende benadering om de werkzaamheid van cytotoxische therapieën selectief in kankercellen te verhogen. Hiertoe verlaagde transfectie-geforceerde expressie van Smac/DIABLO de drempel voor TRAIL-geïnduceerde doding in verschillende tumoren (Ng en Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) en sensibiliseerde ook kankercellen voor chemotherapie (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). De translocatie van endogeen Smac/DIABLO naar het cytosol tijdens door antikankermedicijnen geïnduceerde apoptose blijkt echter onder bepaalde omstandigheden geen belangrijke rol te spelen, bijvoorbeeld bij menselijke longcarcinomacellen na behandeling met etoposide (Bartling et al., 2004). Downregulatie van Smac/DIABLO door small interfering RNA (siRNA) had geen invloed op het doden door etoposide in deze cellen, hoewel een IAP-bindend peptide Smac-N7 etoposide-geïnduceerde apoptose versterkte (Bartling et al., 2004). Deze gegevens suggereren dat Smac/DIABLO-deficiëntie kan worden gecompenseerd door de werking van overbodige determinanten in bepaalde kankercellen.

Mitochondriale mediatoren van caspase-onafhankelijke apoptose

Na vrijlating uit de mitochondriale intermembraanruimte draagt HtrA2/OMI ook bij aan celdood op een caspase-onafhankelijke manier als protease, naast het bevorderen van apoptose op een caspase-afhankelijke manier door het tegenwerken van IAP’s (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). In vitro gegevens toonden de afbraak aan van XIAP, cIAP1, cIAP2 en Apollon door de protease activiteit van HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Bovendien toonden Trencia et al. (2004) de interactie aan van anti-apoptotisch PED/PEA-15 met, en de afbraak ervan door, cytosolisch HtrA2/OMI. Verlaging van de niveaus van HtrA2/OMI in cellen door antisense of RNA-interferentie verlaagt de gevoeligheid van verschillende kankercellijnen voor celdood geïnduceerd door staurosporin, Fas, UV of cisplatine (Martins et al, Verder komen AIF en endonuclease G vrij uit de mitochondriën bij permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan en transloceren zij naar de kern om bij te dragen tot nucleaire chromatinecondensatie en DNA-fragmentatie op grote schaal (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Of deze twee eiwitten vóór, samen of na cytochroom c worden vrijgemaakt, is omstreden besproken (Arnoult et al., 2002). Ook is nog steeds niet precies duidelijk hoe AIF bijdraagt aan de fragmentatie van kern-DNA, aangezien het geen intrinsieke DNase-activiteit heeft. In zoogdiercellen werkt cyclophiline A, een peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, samen met AIF om DNA-afbraak te induceren (Cande et al., 2004).

Ontsnapping van de intrinsieke route bij kanker

Mutaties in genen die betrokken zijn bij de regulatie van de mitochondriale route komen veel voor in kankercellen. Aangezien de meeste antikankertherapieën apoptose in kankercellen induceren door de intrinsieke route in werking te stellen, worden dergelijke mutaties gewoonlijk geassocieerd met resistentie tegen de behandeling. Zo wordt overexpressie van Bcl-2, als gevolg van chromosomale translocatie van het bcl-2 oncogen in het immunglobuline zware keten gen, in verband gebracht met ongeveer 85% van de humane folliculaire lymfomen (Tsujimoto et al., 1984). Experimenten met transgene muizen hebben aangetoond dat Bcl-2 overexpressie neoplastische transformatie van B- en T-lymfocyten en myeloïde cellen kan bevorderen (McDonnell en Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Gezien het feit dat overexpressie van anti-apoptotische leden van de Bcl-2 familie oncogenese bevordert, volgt hieruit dat pro-apoptotische leden van deze familie met meerdere BH-domeinen als tumoronderdrukkers fungeren. Aangezien Bax en Bak echter grotendeels overlappende rollen hebben in apoptose, is het moeilijk om te bepalen of deze hypothese opgaat en inderdaad zijn bax-/- muizen niet duidelijk vatbaar voor neoplasie (Knudson et al., 2001). Er zijn echter somatische mutaties die het bax-gen inactiveren gevonden in bepaalde vaste tumoren en hematologische maligniteiten. In dit verband zijn enkelvoudige nucleotide substitutie of frameshift mutaties beschreven, die het Bax gen inactiveren in mismatch repair-deficient (MMR) colonkanker of hematopoetische maligniteiten (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Bovendien is er toenemend bewijs dat BH3-only eiwitten kunnen bijdragen tot de onderdrukking van maligne transformatie, wat erop wijst dat zij kunnen functioneren als bonafide tumoronderdrukkers. Zo werd bijvoorbeeld aangetoond dat het verlies van één allel van Bim de lymfomagenese van B-cellen versnelt, geïnduceerd door expressie van een c-myc transgen (Egle et al., 2004), in overeenstemming met de sleutelrol van Bim als regulator van lymfoïde homeostase (Strasser, 2005). Interessant is dat homozygote deleties in de chromosomale regio die het bim-gen herbergt, onlangs werden geïdentificeerd bij patiënten met mantelcellymfoom (Tagawa et al., 2005). Muizen zonder bid ontwikkelen spontaan een myeloproliferatieve aandoening die kan uitmonden in een maligniteit die lijkt op chronische myelomonocytische leukemie (CMML) (Zinkel et al., 2003). Bovendien werd RNAi-gemedieerde onderdrukking van Puma gerapporteerd om Myc-geïnduceerde lymfomagenese te versnellen (Hemann et al., 2004).

Naast genetische veranderingen wordt afwijkende expressie van Bcl-2 familie-eiwitten meestal gereguleerd op transcriptioneel of post-transcriptioneel niveau. Zo wordt de expressie van verschillende anti-apoptotische Bcl-2 familie-eiwitten, bijvoorbeeld Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 of Bfl-1, transcriptioneel gereguleerd door NF-κB (Cory en Adams, 2002).

Naast Bcl-2 familie-eiwitten werd verminderde of afwezige activiteit van Apaf-1 gevonden in ovariumkanker, melanoom en leukemie. Bovendien beïnvloeden mutaties in het tumoronderdrukkende gen p53, het meest voorkomende genetische defect in kanker bij de mens, de intrinsieke route. Zo verhoogt activering van p53 de regulatie van een aantal genen die p53-responsieve elementen in hun promotors bezitten, zoals de proapoptotische BH3-eiwitten Puma, Noxa en Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Daardoor zijn cellen waarin p53 gestabiliseerd is, gevoelig voor activering van de mitochondriale celdoodroute. Bovendien kan p53 de integriteit van de mitochondriën direct beïnvloeden zonder dat genactivatie nodig is. Er is namelijk gerapporteerd dat p53 zich kan binden aan Bcl-2 en Bcl-XL in de mitochondriën, waardoor het de mitochondriale destabilisatie bevordert (Mihara et al., 2003).

Signalering via de intrinsieke route bij kankertherapie

De meeste conventionele chemotherapeutische middelen, bijvoorbeeld etoposide, doxorubicine, cisplatine of paclitaxel, ontlokken op indirecte wijze mitochondriale permeabilisatie door verstoringen van het intermediaire metabolisme teweeg te brengen of door de concentratie van proapoptotische tweede boodschappers te verhogen, bijvoorbeeld door p53-expressie te induceren, door de ceramide/GD3-route te induceren, door het CD95/CD95L-ligandsysteem te induceren, door Bcl-2-achtige eiwitten te beïnvloeden en/of door de redox- of energiebalans in gevaar te brengen.

Er zijn steeds meer aanwijzingen voor het bestaan van een nucleo-mitochondriale cross-talk na DNA-beschadiging. Zo kunnen apoptotische signalen als gevolg van DNA-beschadiging via de tumorsuppressor p53 worden doorgegeven aan de mitochondriën, die op hun beurt apoptogene factoren in het cytoplasma vrijgeven die stroomafwaartse vernietigingsprogramma’s activeren (Moll et al., 2005). p53 kan indirect de mitochondriale route in werking stellen door transcriptioneel de expressie van proapoptotische Bcl-2 eiwitten te activeren, bijvoorbeeld Bid, Puma of Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Bovendien kan p53 direct permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan veroorzaken op een transcriptie-onafhankelijke manier door directe activering van pro-apoptotische Bcl-2 eiwitten Bax of Bak of door binding en inactivering van anti-apoptotische Bcl-2 eiwitten zoals Bcl-2 of Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Belangrijk is dat recent is aangetoond dat mitochondriaal gericht p53 ook in vivo tumoronderdrukkende activiteiten bezit (Talos et al., 2005).

Bovendien bezit caspase-2 het vermogen om de mitochondriale apoptotiekroute in werking te stellen als reactie op DNA-schade door het buitenste mitochondriale membraan te permeabiliseren en/of door de associatie van cytochroom c met het binnenste mitochondriale membraan te verbreken. Vandaar dat cellen die stabiel getransfecteerd zijn met procaspase-2 antisense, of die tijdelijk siRNA tot expressie brengen, ongevoelig zijn voor het vrijkomen van cytochroom c en verschillende door DNA-beschadiging geïnduceerde stroomafwaartse gebeurtenissen, zoals caspase-activering en DNA-fragmentatie (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Caspase-2 kan indirect inwerken op de mitochondriën, bijvoorbeeld door het proapoptotische eiwit Bid te klieven, waarna het naar de mitochondriën wordt getranslokeerd om het vrijkomen van cytochroom c te induceren (Guo et al., 2002). Bovendien kan caspase-2 het buitenste mitochondriale membraan direct permeabiliseren en het vrijkomen van cytochroom c en Smac/DIABLO stimuleren, mogelijk als gevolg van directe interactie van verwerkt caspase-2 met vermoedelijke eiwitten en/of fosfolipiden die zich in het buitenste mitochondriale membraan bevinden, of op contactplaatsen tussen het buitenste en binnenste membraan (Robertson et al., 2004). Permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan vereist verwerking van het caspase-2 zymogeen maar niet de geassocieerde proteolytische activiteit en gebeurt onafhankelijk van verschillende Bcl-2 familie-eiwitten, waaronder Bax, Bak en Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Verder bleek caspase-2 ook het verrassende vermogen te hebben om de associatie tussen cytochroom c en anionische fosfolipiden, met name cardiolipine, te verbreken, waardoor extra cytochroom c beschikbaar komt voor vrijlating in het cytosol (Enoksson et al., 2004). Onlangs werd gemeld dat bij DNA-beschadiging caspase-2 wordt geactiveerd in het zogenaamde PIDDosoom, een complex van het p53-induceerbare, doodsdomein-bevattende eiwit PIDD, caspase-2 en het adaptoreiwit RAIDD (Tinel en Tschopp, 2004), hetgeen wijst op het bestaan van een nucleo-mitochondriale apoptotiekroute.

Voorts is gemeld dat histon H1.2 een belangrijke rol speelt bij het doorgeven van apoptotische signalen van de celkern naar de mitochondriën na DNA dubbelstrengsbreuken (Konishi et al., 2003). Nucleair histon H1.2 komt vrij in het cytoplasma via een p53-afhankelijk mechanisme na DNA dubbelstrengsbreuken en induceerde het vrijkomen van cytochroom c uit geïsoleerde mitochondriën op een Bak-afhankelijke manier (Konishi et al., 2003). Vermindering van H1.2 expressie verbeterde de cellulaire weerstand tegen apoptose geïnduceerd door röntgenstraling of etoposide (Konishi et al., 2003).

Bovendien is de wees kernreceptor Nur77 (ook bekend als TR3) onlangs gekoppeld aan de Bcl-2 apoptotische machinerie in de mitochondria (Lin et al., 2004). Binding van Nur77 aan de N-terminale lus regio van Bcl-2, gelegen tussen de BH4 en BH3 domeinen, induceert een conformatieverandering van Bcl-2 die het BH3 domein blootlegt, resulterend in de omzetting van Bcl-2 van een beschermer naar een moordenaar (Lin et al., 2004). Interessant is dat verhoogde niveaus van een Nur77-familielid in verband zijn gebracht met gunstige reacties op chemotherapeutische middelen bij patiënten (Shipp et al., 2002).

Daarnaast worden bij cellulaire stress, waaronder chemotherapeutische middelen, specifieke proapoptotische Bcl-2 familieleden geactiveerd, gederepresseerd of geïnduceerd, en fungeren daarbij als sensoren. De activiteit van BH3-only eiwitten wordt door verschillende mechanismen in toom gehouden, waardoor deze eiwitten onder normale omstandigheden uit de buurt blijven van de multidomein Bcl-2 tegenhangers, maar hun snelle activering onder stress toestaan (Bouillet en Strasser, 2002). Zoals hierboven vermeld, staan Bcl-2 familie-eiwitten zoals Bid, Puma of Noxa onder de transcriptionele controle van de tumorsuppressor p53 en worden ze bijgevolg geüpreguleerd als reactie op DNA-beschadigende agentia (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Het BH3-only eiwit Bim, dat geassocieerd is met het cytoskelet door zich te binden aan microtubuli, wordt vrijgemaakt en activeert de intrinsieke route na behandeling met taxol, dat inwerkt op de assemblage van microtubuli (Sunters et al., 2003). Onlangs is aangetoond dat paclitaxel Bim-accumulatie en Bim-afhankelijke apoptose induceert in epitheliale tumoren in vitro en ook in vivo (Tan et al., 2005). Actieve BH3-eiwitten binden zich aan anti-apoptotische en in sommige gevallen activeren ze multidomein pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie, wat leidt tot het verlies van mitochondriale membraanpermeabiliteit (Bouillet en Strasser, 2002). Hoe Bcl-2 eiwitten de verstoring van de mitochondriale buitenmembraan induceren is nog steeds een punt van discussie en kan te maken hebben met de porievormende en zelf-oligomeriserende capaciteit van sommige Bcl-2 familie-eiwitten, modulatie van de mitochondriale permeabiliteits overgangsporie door Bcl-2 familie-eiwitten en/of lipideveranderingen en lipide-eiwit interacties binnen de mitochondriale membranen. Bovendien veroorzaken chemotherapeutische middelen zoals paclitaxel hyperfosforylering en inactivering van Bcl-2, en bevorderen zij tegelijkertijd de opening van de permeabiliteitsovergang (PT)-porie (Ruvolo et al, Chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen ook permeabilisatie van de buitenste mitochondriale membraan induceren of vergemakkelijken door veranderingen in de cellulaire redoxpotentialen als gevolg van een verhoogde generatie van reactieve zuurstofspecies (of een afname van hun ontgifting), depletie van gereduceerd glutathion of depletie van NADPH, aangezien het mitochondriale megakanaal verscheidene redox-gevoelige plaatsen bezit (Debatin et al., 2002). Bovendien kunnen veranderingen in het energiemetabolisme, bijvoorbeeld een tekort aan ADP en ATP, het openen van het permeabiliteitsporecomplex (PTPC) vergemakkelijken, aangezien ADP en ATP de fysiologische liganden zijn van de adenine nucleotide translocator, die fungeren als endogene remmers van het PTPC (Costantini et al., 2000). Ook ontkoppeling of remming van de ademhalingsketen of matrixalkalinisatie kunnen mitochondriale membraanpermeabilisatie bevorderen. Bovendien kunnen lipide boodschappers zoals ceramide, dat wordt gegenereerd in cellen die worden blootgesteld aan verschillende apoptose-inducerende stimuli, waaronder cytotoxische geneesmiddelen, bijdragen tot mitochondriale membraanpermeabilisatie (Susin et al., 1997). Bij hoge concentraties kunnen sommige chemotherapeutische geneesmiddelen, bijvoorbeeld etoposide of paclitaxel, ook leiden tot mitochondriale permeabilisatie van de buitenmembraan in geïsoleerde mitochondriën (Robertson et al., 2000; Kidd et al, Bovendien is van een toenemend aantal experimentele antikankermedicijnen, waaronder arseniet, lonidamide, het synthetische retinoïde CD437 of het natuurlijke product betulininezuur, aangetoond dat zij rechtstreeks op mitochondriën inwerken (Debatin et al., 2002). Van betulinezuur is bijvoorbeeld bekend dat het apoptose induceert door direct verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal in geïsoleerde mitochondriën te induceren, op een manier die niet wordt beïnvloed door de caspaseremmer Z-VAD-fmk en wel wordt geremd door BA, een remmer van de PTPC, of door Bcl-2 en Bcl-XL (Fulda et al.,

Strategieën gericht op de intrinsieke route

Bcl-2 familie-eiwitten

Omdat anti-apoptotische Bcl-2 eiwitten, die krachtig de intrinsieke apoptose route blokkeren, in verhoogde concentraties worden aangetroffen in humane kankers van zowel hematologische als niet-hematologische oorsprong (Cotter, 2004), vormen zij veelbelovende doelen voor therapeutische interventies. Daarom zijn er verschillende strategieën ontwikkeld om Bcl-2 eiwitten aan te pakken, bijvoorbeeld antisense technieken, BH3-domein peptiden of synthetische kleine molecule geneesmiddelen die interfereren met de functie van Bcl-2-achtige eiwitten. Om de expressie van Bcl-2 te downreguleren werden Bcl-2 antisense oligonucleotidex (genasense) ontwikkeld door Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense is een synthetisch, 18 basen, enkelstrengs fosforothioaat oligonucleotide dat zich selectief richt op de eerste zes codons (d.w.z. 18 basen) van het mRNA open leesraam dat codeert voor het Bcl-2 eiwit (Cotter, 2004). Behandeling met genasense heeft de antitumoractiviteit van veel chemotherapeutica aanzienlijk verbeterd, bijvoorbeeld taxanen, anthracyclinen, alkylatoren of platina-bevattende middelen (Cotter, 2004). In een preklinisch model van melanoom verhoogde voorbehandeling met genasense de chemosensitiviteit van humaan melanoom (Jansen et al., 1998). Ook in een klinische studie werd gerapporteerd dat genasense werkt als chemosensibilisator voor dacarbazine bij patiënten met kwaadaardig melanoom (Jansen et al., 2000). Om de op antisense gebaseerde therapie te optimaliseren, werden vervolgens bispecifieke antisense oligonucleotiden gericht tegen een sequentie, die zeer homoloog is in Bcl-2 en Bcl-xL, maar ontbreekt in Bcl-xS mRNA, ontworpen (Zangemeister-Wittke et al., 2000). Gelijktijdige downregulatie van zowel Bcl-2 als Bcl-xL induceerde apoptose en verhoogde chemosensitiviteit in verschillende kankercellen (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Daarnaast werden BH3-domein peptiden of synthetische kleine molecule remmers ontwikkeld om anti-apoptotische Bcl-2-achtige eiwitten aan te pakken. Het BH3-domein bestaat uit een negen-amino-acid amfipatische α-helix die zich bindt aan een hydrofobe zak van Bcl-2-achtige eiwitten (Cory en Adams, 2002). Ook peptiden met een BH3-domein hebben tot doel dit complex te ontregelen en zo kankercellen gevoelig te maken voor apoptose (Letai et al., 2002). Bovendien resulteerde substitutie van het Bid BH3 domein met niet-natuurlijke aminozuren op het oppervlak tegenover het interagerende gebied door koolwaterstof stapling in gestabiliseerde BH3 peptiden, SAHBs genoemd (stabilized α-helix of Bcl-2 domains), met verbeterde farmacologische eigenschappen (Walensky et al., 2004). Deze gestabiliseerde BH3 peptiden veroorzaakten apoptose in een verscheidenheid van leukemische cellijnen en remden ook de groei van leukemie xenotransplantaten in muizen zonder nadelige bijwerkingen (Walensky et al., 2004).

Ook zijn verschillende kleine molecule verbindingen geïdentificeerd die interfereren met Bcl-2/Bcl-xL functie. Screening van een chemische bibliotheek voor verbindingen die kunnen binden aan de BH3-zak van Bcl-2-eiwitten resulteerde in de identificatie van HA14-1, een verbinding die concurreert met Bak voor de binding aan Bcl-2 (Wang et al., 2000). Door een bibliotheek van 16 320 vooraf geselecteerde verbindingen te screenen op het vermogen om een fluorescerend Bak BH3 peptide te verdringen van Bcl-xL in een fluorescente polarisatie assay, identificeerden Degterev et al. (2003) twee klassen van middelen genaamd BH3 inhibitors (BH3Is), die ook het Bcl-xL complex met Bax en Bad in intacte cellen verstoren.

Met behulp van screening op basis van kernspinresonantie (NMR), parallelle synthese en structuurgebaseerd ontwerp werd onlangs een kleine molecule-remmer van de anti-apoptotische eiwitten Bcl-2, Bcl-X(L) en Bcl-w, ABT-737, ontdekt. ABT-737 was effectief als enkelvoudig middel tegen bepaalde lymfomen en solide tumoren en vertoonde synergetische cytotoxiciteit met chemotherapeutica en bestraling (Oltersdorf et al., 2005).

Smac/DIABLO agonisten

Voor het ontwerp van potentieel therapeutische kleine moleculen die zich richten tegen XIAP, heeft de bindingsgroef van het BIR3-domein van XIAP, waaraan Smac/DIABLO zich bindt na zijn vrijlating uit de mitochondriën, de meeste aandacht getrokken. Structurele analyse heeft een duidelijke rationale opgeleverd voor de synthese van kleine verbindingen die de caspase-9-verplaatsende activiteit van Smac/DIABLO van XIAP BIR3 kunnen nabootsen (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Om de intracellulaire afgifte te verbeteren werden Smac-peptiden gekoppeld aan een drager, bijvoorbeeld het eiwittransductiemotief van het HIV Tat-eiwit (Fulda et al., 2002), de Drosophila antennapaedia penetratine-sequentie (Arnt et al., 2002) of een polyarginine-stretch (Yang et al., 2003b). Van een heptapeptide die de N-terminus van rijp Smac/DIABLO vertegenwoordigt, en die essentieel is voor binding aan XIAP, werd gemeld dat het caspase-activering bevordert en verschillende tumorcellijnen en ook primaire tumorcellen van patiënten gevoelig maakt voor apoptose die wordt geïnduceerd door dood-receptor ligatie of cytotoxische geneesmiddelen (Fulda et al., 2002). Belangrijk is dat Smac-peptiden zelfs de antitumoractiviteit van TRAIL in vivo versterkten in een intracraniaal maligne glioma xenograft model (Fulda et al., 2002b). Evenzo was een 8-mer peptide (AVPIAQKS), gefuseerd met het eiwittransductiedomein van Drosophila antennapaedia penetratine, in staat borstkankercellen binnen te dringen, XIAP en cIAP1 te binden, en de caspase-activiteit, geïnduceerd door een aantal antikankergeneesmiddelen, waaronder paclitaxel, etoposide, 7-ethyl-10-hydroxycamptothecine (SN-38) en doxorubicine, te versterken (Arnt et al., 2002). Bovendien werden op basis van de driedimensionale structuur van Smac/DIABLO in complex met XIAP BIR3, Smac peptidomimetica ontworpen die samenwerkten met TRAIL, TNFα, cisplatine of etoposide om apoptose in tumorcellen teweeg te brengen (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Subsequently, non-peptidic small molecule antagonists of XIAP, which were derived by screening of a phage library or polyphenylurea library, were developed for targeting IAPs (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Daarnaast werd onlangs het natuurlijke product embelin van het Japanse Ardisia kruid ontdekt als een cel-permeabele, niet-peptidische, klein-moleculaire remmer van XIAP door middel van structuur-gebaseerde computationele screening van een traditionele kruidengeneeskunde driedimensionale structuur database (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Embelin bleek het beschermende effect van XIAP effectief te ondermijnen in prostaatkankercellen met hoge endogene XIAP niveaus of in Jurkat cellen getransfecteerd met XIAP door binding aan het XIAP BIR3 domein (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Smac-agonisten of laagmoleculaire XIAP-antagonisten kunnen dus veelbelovende kandidaten zijn voor kankertherapie door de werkzaamheid van cytotoxische therapieën selectief in kankercellen te versterken.