Fluorescente Eiwitten van A. victoria
De spectrale eigenschappen van GFP of zijn varianten liggen in de aminozuurstructuur die de chromofoor vormt (figuur 1). Dit kunnen de drie aminozuren op de posities 65-67 zijn of residuen dicht bij deze plaats (b.v. YFP). Naast de belangrijkste mutaties met betrekking tot de chromofoor is ook onderzoek verricht naar andere gerichte mutagenese om andere factoren zoals eiwitrijping en expressie in heterologe celsystemen te verbeteren (b.v. codongebruik, eiwitvouwing bij fysiologische temperatuur). Merk op dat A. victoria is een relatief primitief marien organisme zonder lichaamswarmtesysteem.
Zelfs als GFP is een van de meest populaire FPs vanwege zijn helderheid en hoge fotostabiliteit, het heeft twee belangrijke nadelen. Dit zijn een zekere gevoeligheid voor pH en een lichte neiging tot dimeren. Dimerisatie of oligomerisatie is een probleem van veel FPs. Hun voorkeur om met elkaar te agglutineren kan leiden tot artefacten of misinterpretaties betreffende de plaats en functie van het gefuseerde eiwit. Maar ook voor dat probleem hebben wetenschappers enkele antwoorden gevonden. Mutaties op kritieke posities (F223R, L221K en A206K) waar apolaire aminozuren worden vervangen door hydrofiele, vertonen een verminderde dimerisatie. Alle genetische veranderingen die leiden tot een verbetering van zowel spectrale als praktische eigenschappen worden samengevat onder de naam “verbeterde” FP’s.
In het geval van wtGFP leiden de verbeteringen tot een EGFP (enhanced GFP) met een enkele excitatiepiek bij 488 nm in plaats van het vroegere complexe absorptiespectrum bij 395 nm en 475 nm. De eerste gemuteerde versie van wtGFP (de S65T-mutant), ontwikkeld door Roger Tsien et al., was vijf keer helderder dan het origineel en vertoonde een kortere rijpingstijd. Samen met een betere rijpingsefficiëntie bij 37°C, gebaseerd op een andere mutatie (F64L), speelt dit een belangrijke rol voor mensen die naar levende cellen kijken.
Een zeer interessante GFP-variant met een van de grootste Stokes-verschuivingen is Sapphire. Een mutatie op een positie dicht bij de chromofoor (T203I) leidt tot een wijziging van het excitatiemaximum naar 399 nm en het emissiemaximum naar 511 nm. Dit is een Stokes-verschuiving van 112 nm. Emerald is een andere GFP modificatie met verbeterde fotostabiliteit en helderheid en efficiëntere vouwing in zoogdiercellen.
Terwijl alle groene fluorescente proteïnen een relatief hoge helderheid hebben, hebben blauwe fluorescente proteïnen gewoonlijk te lijden van verminderde emissie-intensiteit in microscopische toepassingen. Niettemin worden zij gebruikt in optische analyses wegens andere spectrale eigenschappen. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) werd geconstrueerd door verschillende mutatierondes van wtGFP. De eerste (Y66H) sloeg de emissiepiek over van het groene naar het blauwe spectrum. Meer mutaties volgden, waardoor een eiwit ontstond met een excitatiemaximum bij 380 nm en een emissiemaximum bij 448 nm. Deze spectrale eigenschappen maken het tot een partner voor EGFP in FRET-microscopie. Recente blauw fluorescerende proteïnen met hogere kwantumopbrengsten en betere fotostabiliteit zijn Azurite, SBFP2 en EBFP2. Een veelbelovende EBFP opvolger is een eiwit genaamd Sirius dat populair werd vanwege zijn zeer hoge tolerantie voor pH (stabiel van pH 3-9) en zijn reputatie als het fluorescerende eiwit met de kortste emissiegolflengte tot op heden.
Een tweede “blauwe” klasse van GFP varianten wordt gevormd door cyaan fluorescerende eiwitten: GFP’s. Substitutie van tyrosine door tryptofaan (Y66W) en verdere genetische wijzigingen leiden tot een fluorochroom met verbeterde helderheid en fotostabiliteit. Dit ECFP heeft een bimodaal excitatie- en emissiespectrum bij 433/445 nm en 475/503 nm. De helderheid bedraagt slechts ongeveer 40 % van die van EGFP. Een belangrijke ECFP-variant is Cerulean, dat een hogere extinctiecoëfficiënt en quantumopbrengst heeft. Het is 1,5 maal helderder dan EGFP en wordt gebruikt als FRET-partner met YFP.
Een GFP-mutatie waarbij een van de drie centrale aminozuren in de chromofoor niet rechtstreeks wordt gewijzigd, heeft geleid tot de opkomst van gele fluorescente proteïnen. YFP’s hebben een gemeenschappelijke threonine op positie 203 die is vervangen door een tyrosine (T203Y). Dit aminozuur maakt deel uit van de β-barrel en ligt in de onmiddellijke nabijheid van de chromofoor. In vergelijking met GFP zijn de excitatie- en emissie-eigenschappen verschoven naar langere golflengten met excitatie- en emissiemaxima bij 514 nm en 527 nm (EYFP). Een kenmerk van EYFP is zijn pH-gevoeligheid. Bij pH 6,5 heeft EYFP slechts ongeveer 50 % van zijn fluorescentie, wat niet altijd een nadeel is. Bij het meten van de pH (b.v. van vesikels, endosomen, enz.) kan EYFP als indicator worden gebruikt. Interessant is dat een volgende mutatie (Q69M) een betere zuurstabiliteit en een sterk verbeterde helderheid (75% helderder dan EGFP) tot gevolg heeft. Dit eiwit, dat nog steeds een slechte fotostabiliteit heeft in vergelijking met EGFP, werd Citrine genoemd. Een andere YFP-mutant (F46L) vertoonde een drastisch snellere rijpingssnelheid en ook een verbeterde pH-bestendigheid. Dit eiwit werd Venus genoemd en is een frequente FRET-acceptor met Cerulean.