Verrassende ontdekking van een nieuwe route die wordt gestuurd door het Notch-signaaleiwit opent deur voor betere geneesmiddelenontwikkeling
Door Lindsay Brownell
(BOSTON) – Elke minuut stroomt anderhalve liter bloed door het netwerk van aderen en slagaders van het lichaam. De kracht van die bloedstroom helpt de cellen die de bloedvaten bekleden, endotheelcellen genaamd, gezond te houden; wanneer de bloedstroom wordt verstoord, zoals tijdens chirurgische ingrepen of een beroerte, beginnen de bloedvaten te lekken, wat een groot aantal ontstekingsreacties kan veroorzaken die leiden tot celbeschadiging en ziekte. Wetenschappers van het Wyss-instituut aan de Harvard-universiteit probeerden het mysterie op te lossen van de manier waarop de bloedstroom de bloedvaten intact houdt en ontdekten tot hun verrassing een volledig nieuwe celsignaleringsroute die een veelbelovend doelwit vormt voor geneesmiddelen om een aantal slopende aandoeningen te behandelen.
“We hebben ontdekt dat het bekende Notch-eiwit ervoor zorgt dat bloedvaten niet lek worden, en dat doet via een secundaire signaalroute die op een heel andere manier werkt dan de bekende transcriptie-gebaseerde route,” zegt Chris Chen, M.D., Ph.D., geassocieerd lid van de faculteit van het Wyss Institute en stichtend directeur van het Biological Design Center en bijzonder hoogleraar biomedische techniek aan de Universiteit van Boston, die de corresponderende auteur van het artikel is. “Deze nieuwe route is niet alleen opwindend vanuit een ontdekkingsperspectief, maar kan ook enkele bijwerkingen van geneesmiddelen tegen kanker en hart- en vaatziekten verbeteren, zodat ze veiliger en effectiever worden.” De studie wordt vandaag gepubliceerd in Nature.
De endotheelcellen die de bloedvaten bekleden zijn nauw met elkaar verbonden door verbindingen die adherens juncties worden genoemd om een barrière te vormen die het bloed in het vat houdt en regelt hoe gemakkelijk andere stoffen erin en eruit kunnen. Om deze barrière te bestuderen en te bepalen waarom een gebrek aan bloedstroom lekkage veroorzaakt, bouwden de onderzoekers een bloedvat-op-een-chip model bestaande uit een kanaal bekleed met een laag menselijke endotheelcellen omgeven door extracellulaire matrix binnen een microfluïdisch apparaat, waardoor ze gemakkelijk de bloedstroom door een vat konden simuleren en controleren en de reacties van de cellen konden evalueren.
Endotheelcellen die bloedstroom ondervonden, vertoonden verhoogde activiteit van het transmembraaneiwit Notch1, terwijl cellen blootgesteld aan stilstaand bloed dit niet deden. Toen de onderzoekers een chemische stof toevoegden die de activering van Notch1 blokkeert door te verhinderen dat het intracellulaire domein loslaat, stelden zij vast dat het bloedvat begon te lekken, wat zij veroorzaakten door de verstoring van adherens juncties tussen naburige endotheelcellen en de reorganisatie van actinevezels binnen elke cel. Dit bevestigde dat activering van Notch1 door bloedstroom noodzakelijk is voor de vorming en het behoud van de endotheelbarrière van bloedvaten.
Vreemd genoeg verhinderde het verhinderen van Notch1’s intracellulaire domein om transcriptie te initiëren na loslating (wat het welbekende werkingsmechanisme van Notch1 is) niet dat de bloedvaten lekten, wat impliceerde dat een ander deel van het eiwit waarvan de functie geen transcriptie inhoudt, reageerde op de bloedstroom. Dit vermoeden werd versterkt door in vivo experimenten waarbij de wetenschappers muizen injecteerden met een chemische stof die Notch1 blokkeerde samen met blauwe kleurstof, en zagen dat de kleurstof uit de bloedvaten van de behandelde muizen lekte in een veel sneller tempo dan verwacht. “De transcriptie van een gen in een eiwit dat vervolgens een of andere functie binnen de cel uitvoert, duurt doorgaans ongeveer twee uur, maar wij zagen lekkage binnen 30 minuten, wat er verder op wijst dat het proces dat de permeabiliteit van de barrière regelt, via een heel ander mechanisme werkt,” aldus Bill Polacheck, Ph.D., Ph.D., postdoctoraal medewerker aan het Wyss Institute en coauteur van het artikel.
Toen ze eenmaal hadden vastgesteld dat het intracellulaire domein niet betrokken was bij het reguleren van de endotheelbarrière, onderzochten de wetenschappers andere delen van Notch1 op activiteit. Ze gebruikten CRISPR/Cas-9 om verschillende secties van het Notch1-gen te verwijderen, en ontdekten dat het verwijderen van de sectie die codeert voor het intracellulaire domein geen effect had op de permeabiliteit, terwijl het verwijderen van de kleine transmembrane domain (TMD) sectie er ook voor zorgde dat de lekkage van de vaten toenam onder stromingsomstandigheden. “Dit is de eerste keer dat de biologische functie van het Notch TMD is geëvalueerd,” zegt Matthew Kutys, Ph.D., een Visiting Fellow aan het Wyss Institute en mede-auteur. “Men ging er grotendeels van uit dat het inert was en gewoon verdween na activering, en de meeste tekstboeken en onderzoekspapers laten het niet eens zien als een apart onderdeel van Notch-receptoren.” Door verder te testen kwamen ze erachter dat wanneer Notch1 wordt geactiveerd en zijn intracellulaire domein wordt vrijgegeven, zijn TMD een complex in het membraan samenstelt met de eiwitten VE-cadherine, Rac1, LAR en Trio, die gezamenlijk de adherens knooppunten tussen cellen samenstellen en onderhouden en actinevezels tegen het celmembraan verspreiden om die knooppunten te ondersteunen.
“Achteraf gezien hebben we met dit project een gokje gewaagd, want door Notch te onderzoeken betraden we een van de meest overvolle onderzoeksgebieden in de biologie. Maar onze op engineering gebaseerde aanpak stelde ons in staat om het op een nieuwe manier te bestuderen, zonder de invloed of vooringenomenheid van werk uit het verleden, wat ons denk ik onbevooroordeeld genoeg heeft gemaakt om dit nieuwe, onverwachte pad te observeren en te karakteriseren,” zegt Polacheck. “De wetenschap dat Notch1 naast celdifferentiatie ook celadhesie reguleert, biedt ook een nieuw kader voor het begrijpen van de coördinatie van complexe cellulaire processen, in die zin dat afzonderlijke moleculen zoals Notch meerdere rollen kunnen spelen,” voegt Kutys toe.
De onthulling dat Notch1 verschillende functies vervult, en weten welke delen van het eiwit elke functie besturen, maakt het mogelijk om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen die zowel effectiever als minder toxisch zijn. “Notch is een doelwit voor sommige kankertherapieën, maar het is bekend dat die geneesmiddelen oedeem en andere problemen veroorzaken. Nu werken we actief aan het scheiden van de twee paden van Notch, zodat we medicijnen kunnen ontwikkelen die zich alleen richten op het intracellulaire domein, waardoor het TMD gespaard blijft en dus de integriteit van de bloedvaten behouden blijft,” zegt Karen Hirschi, Ph.D., hoogleraar Geneeskunde en Genetica aan de Yale School of Medicine, die meewerkte aan de studie. De wetenschap dat Notch de doorlaatbaarheid van bloedvaten regelt, maakt het een kandidaat voor nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van hart- en vaatziekten, en het team onderzoekt ook de TMD als een potentieel therapeutisch middel zelf, omdat celmodellen die werden blootgesteld aan een ontsteking die lekkage veroorzaakte, een dramatische vermindering van lekkage vertoonden toen ze werden gemanipuleerd om de TMD tot expressie te brengen.
“De samenwerking die het Wyss-instituut mogelijk maakt en koestert tussen ongelijksoortige vakgebieden, zoals werktuigbouwkunde en moleculaire biologie, bevordert nieuwe benaderingen van oude problemen die kunnen leiden tot werkelijk paradigma-verschuivende resultaten,” zegt Donald Ingber, M.D. Ph.D., de stichtend directeur van het Wyss-instituut en de Judah Folkman hoogleraar vasculaire biologie aan de Harvard Medical School en het vasculaire biologieprogramma van het Boston Children’s Hospital, die ook hoogleraar bio-engineering is aan de Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). “Deze studie is een uitstekend voorbeeld van de voordelen die dit soort partnerschappen kunnen bieden aan de wetenschap en de samenleving.”
Aanvullende auteurs van de studie zijn Jinling Yang, Ph.D., postdoctoraal Fellow aan het Wyss Institute; Jeroen Eyckmans, Ph.D., voormalig Wyss Postdoctoraal Fellow en huidig Groepsleider aan de Boston Universiteit; Yinyu Wu, een Graduate Student in de Afdeling Genetica aan Yale; en Hema Vasavada, Lab Manager aan de Yale School of Medicine.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH), de National Science Foundation (NSF), een Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation, en het Wyss Institute aan de Harvard University.
- PUBLICATIE – Nature: Een niet-kanoniek Notch-complex reguleert adherens-juncties en vasculaire barrièrefunctie