Virus and cells
Niet anders vermeld, werden alle experimenten uitgevoerd met een klinisch influenza virus isolaat in MDCK cellen A/Memphis/14/96-M (H1N1), vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA). De virussen beschreven in Fig. 5 werden vriendelijk ter beschikking gesteld door de collega’s vermeld in de Acknowledgements.
MDCK cellen en MDCK-SIAT1 cellen stabiel getransfecteerd met 2,6-sialyltransferase voor verbeterde expressie van Neu5Ac2-6Gal-terminated oligosacchariden werden eerder beschreven . We vermeerderden beide soorten cellen in DMEM (Gibco) aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal kalfsserum en antibiotica (streptomycine, 100 mg / ml en penicilline, 100 U / ml).
Overlay media
Als het vloeibare onderhoudsmedium (MM) voor virusinfectie, gebruikten we Eagle’s MEM met L-glutamine, 0,1% BSA (Sigma, A-0336), antibiotica en 1 ug / ml TPCK trypsine (Sigma, T-1426).
Stocks van 1,8% Bacto-Agar (BD, 214010) en 2% methylcellulose (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s bij 2%, Fluka) in gedestilleerd water werden bereid zoals eerder beschreven.
De fabrikant van Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) vriendelijk verstrekt drie soorten Avicel (RC-581, RC-591 en CL-661) voor het testen. We hebben stock-suspensies van Avicel bereid door 2,4 g Avicel-poeder gedurende 1 uur te dispergeren in 100 ml gedestilleerd water op een standaard magneetroerder. Agar, MC en Avicel voorraden werden gesteriliseerd door autoclaveren gedurende 20 minuten bij 121 ° C en opgeslagen bij kamertemperatuur.
De overlays werden bereid door het mengen van voorraadoplossingen van MC, Avicel of gesmolten agar met gelijke volumes van dubbele sterkte onderhoudsmedium. Om de concentratie van MC en Avicel in de overlays te variëren, verdunden we de oorspronkelijke voorraden met steriel water. De agar-overlay werd bereid bij 42-44°C, twee andere overlays werden bereid bij 20 of 37°C.
Geconcentreerde (2,4%) Avicel-voorraden scheidden doorgaans niet tijdens opslag, verdunde Avicel-gebaseerde overlays waren echter minder stabiel. Indien nodig geacht, hebben we Avicel voorraden gemengd, en altijd Avicel overlays gemengd voor gebruik door ofwel te schudden met de hand of vortexen. Langzame scheiding van overlays na hun toepassing op celmonolagen had geen invloed op de assay resultaten.
Plaque assay in 6-well platen
Een uur na het infecteren van de celmonolayers met 30-50 plaque vormende eenheden van het virus in 1 ml onderhoudsmedium zonder trypsine, verwijderden we het virus inoculum, bedekten de cellen met 3 ml van de verschillende overlay media en incubeerden culturen bij 35 ° C in 5% CO2 atmosfeer. In het geval van MC en Avicel overlays werd ervoor gezorgd de platen tijdens de incubatieperiode niet te verstoren om de vorming van ongelijkmatige platen te voorkomen. Na drie dagen incubatie werden de oplegplaten verwijderd en de cellen gefixeerd. Agar-overlay werd verwijderd met een metalen spatel; MC, Avicel en vloeibare overlays werden verwijderd door afzuiging. De cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde oplossing in MEM gedurende 30 min bij 4 ° C en gewassen met PBS. Alle verdere behandelingen van de cellen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. We permeabiliseerden de cellen en blokkeerden gelijktijdig residuele aldehydegroepen door de cellen gedurende 10-20 min te incuberen met 1 ml per putje van een oplossing die 0,5 % Triton-X-100 en 20 mM glycine in PBS bevat. We immuno-gekleurde virus-geïnfecteerde cellen door incubatie gedurende 1 uur met monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor het influenza A-virus nucleoproteïne (vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr Alexander Klimov bij Centers for Disease Control, USA), gevolgd door 1 uur incubatie met peroxidase-gelabelde anti-muis antilichamen (DAKO, Denemarken) en 30 min incubatie met precipitaat-vormende peroxidase substraten. Een oplossing van 10% normaal paardenserum en 0,05% Tween-80 in PBS werd gebruikt voor de bereiding van werkverdunningen van immuno-reagentia. We wasten de cellen na de primaire en secundaire antilichamen door ze driemaal gedurende 3-5 min te incuberen met 0,05% Tween-80 in PBS. Als peroxidasesubstraten gebruikten we ofwel kant-en-klaar True Blue™ (KPL) of een oplossing van aminoethylcarbazool (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml), bereid in 0,05 M natriumacetaatbuffer, pH 5,5 en met 0,03% H2O2. De gekleurde plaatjes werden gewassen met kraanwater om de reactie te stoppen en gedroogd. In het geval van True Blue-kleuring, die betrekkelijk onstabiel is in wateroplossingen, werden de plaatjes omgekeerd gedroogd om bleken tot een minimum te beperken. Gekleurde platen werden gescand op een flat bed scanner en de gegevens werden verkregen door Adobe Photoshop 7.0 software.
Als een alternatief voor immuno-kleuring, in sommige experimenten onthulden we plaques als gebieden van vernietigde cellen. Daartoe, na het verwijderen van de overlays, we gekleurd de cellen met 1% kristalviolet oplossing in 20% methanol in water.
Varianten van het virus titratie in 96-well platen
1. Standaardvariant
We infecteerden MDCK- of MDCK-SIAT1-celmonolayers in 96-wells-platen met 50 μl/well van seriële verdunningen van het virus in het onderhoudsmedium zonder trypsine. Na 1 uur incubatie bij 35 ° C in 5% CO2, verwijderden we het virus, voegden 100 ul / putje van ofwel MC of Avicel overlay media, en geïncubeerd de cellen gedurende nog eens 24 uur om plaquevorming mogelijk te maken. Fixatie en immunokleuring werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven voor 6-well platen, maar met 50 ul reagentia per well.
2. Vereenvoudigde variant
De test werd uitgevoerd precies zoals in de standaard variant met de volgende wijzigingen. Na 1 uur incubatie met het virus, hebben we niet verwijderen van het inoculum. We voegden 100 ul / putje van Avicel overlay media en mengde de plaat hetzij door te tikken met de hand of met behulp van een plaat mixer. De media bevatten verhoogde hoeveelheden trypsine (1,5 μg/ml) ter compensatie van de verdunning van de overlay met het virusbevattende materiaal in de putjes.
Plaque inhibition assay
Noel Roberts (Roche Products, UK) was zo vriendelijk de neuraminidaseremmer oseltamivir carboxylaat (OC) te verstrekken. We voegden 50 ul / putje van seriële 10-voudige verdunningen van OC in onderhoudsmedium zonder trypsine (concentratiebereik van 4 nM tot 400 uM OC) toe aan monolayers van MDCK-SIAT1-cellen in 96-wells-platen. Vervolgens voegden we 50 ul per putje virusverdunningen toe (20-40 plaquevormende eenheden per putje). We mengden de plaat en incubeerden gedurende 1 uur bij 35 ° C om de initiatie van virale infectie mogelijk te maken. Daarna voegden we 100 μl per putje van 1,2% Avicel overlay-media met 2 μg/ml trypsine toe, incubeerden de culturen gedurende 24 uur en fixeerden en immunokleurden ze zoals hierboven beschreven.
In het geval van 6-wells-platen voegden we 0,75 ml aliquots van het geneesmiddel en de remmer en 1,5 ml aliquot Avicel per putje toe en immunokleurden de plaques 3 dagen na infectie.