Omzetting van mRNA in dubbelstrengs cDNA

Enzymatische omzetting van mRNA in dubbelstrengs insert-DNA kan door een aantal verschillende procedures worden bewerkstelligd. Zij impliceren alle de werking van reverse transcriptase en oligonucleotide-primed synthese van cDNA. Daarna lopen de gangbare procedures sterk uiteen. Er zijn een aantal methoden voor de synthese van de tweede streng en verschillende procedures voor het produceren van geschikte uiteinden voor het maken van kloneerbaar DNA. De belangrijkste doelstellingen van deze procedures zijn de constructie van insert-DNA dat zo lang mogelijk is, met een hoog rendement bij de omzetting van mRNA in DNA dat kan ligeren aan vector-DNA. De volgende protocollen vereisen alleen in de handel verkrijgbare reagentia en zijn meestal succesvol in het produceren van goede cDNA bibliotheken. Het basisprotocol beschrijft een methode voor het maken van blunt-ended cDNA dat vervolgens kan worden geligeerd aan linkers voor de daaropvolgende klonering in een unieke restrictie site zoals EcoRI. De Alternate Protocol is een variatie die minder enzymatische manipulaties vereist en maakt de bouw van directionele cDNA bibliotheken, die zijn bijzonder wenselijk wanneer het doel is om expressie cDNA bibliotheken te genereren. De Alternate Protocol maakt gebruik van een linker-primer bestaande uit (in volgorde van 3 ‘naar 5′) een oligo (dT) primer, een restrictie site voor de XhoI endonuclease, en een (GA) 20 herhalen om de restrictie site te beschermen tijdens de generatie van de blunt-ended cDNA. De interne XhoI-plaatsen op de afzonderlijke cDNA-moleculen worden beschermd door incorporatie van 5-methyl-dCTP in de eerste-strengs nucleotidemix. De resulterende cDNA’s met unieke uiteinden kunnen in EcoRI /XhoI-getigesteerde vectoren worden gekloond na ligatie van EcoRI-adapters aan het 5′-uiteinde en digestie door XhoI om de 3′-XhoI-locaties vrij te geven die door de linker-primer in het cDNA zijn opgenomen. Deze veranderingen resulteren in een aanzienlijk gestroomlijnde procedure die aanzienlijk sneller en gemakkelijker is dan het basisprotocol.