Praktijk voor Menselijke Genetica Wenen

Genoombreed zoeken naar microaberraties: Array-CGH

Complexe syndromen op basis van vermeerdering of vermindering van chromosomaal materiaal zijn al lang bekend. Bij trisomie 21, bijvoorbeeld, is een volledig chromosoom drie keer aanwezig in plaats van twee keer. Bij microdeletiesyndromen zoals Williams-Beuren, Prader-Willi of Smith-Magenis ontbreken min of meer afgebakende delen van een chromosoom, meestal op een submicroscopische schaal van enkele megabasen. In het geval van monogenetische ziekten zijn deleties of duplicaties van afzonderlijke genen of gensegmenten onlangs met toenemende frequentie ontdekt als de oorzaak van de ziekte.

De technieken die tot op heden zijn gebruikt voor de diagnose van dergelijke veranderingen in gendosering hebben hun beperkingen: Hoewel bijvoorbeeld moleculair-cytogenetische methoden zoals FISH of moleculair-genetische methoden zoals MLPA met hoge of hoogste resolutie kunnen worden gebruikt, moeten zij a priori weten of aannemen welk gebied van het genoom is aangetast. Anderzijds is er de klassieke cytogenetica of de CGH-techniek (“comparative genomic hybridisation”: Vergelijkende hybridisatie van patiënten- en referentie-DNA op metafasechromosomen) kan het volledige genoom bestrijken, maar de resolutie is door het gebruik van de lichtmicroscoop in het beste geval beperkt tot ongeveer 5 Mb.

Om deze beperkingen van de bestaande technieken te ondervangen, is array-CGH een geschikt alternatief.

Hier wordt de conventionele CGH-techniek gecombineerd met de ervaring die is opgedaan met expressieanalyse met behulp van microarrays: Bepaalde DNA-fragmenten, geïmmobiliseerd op het oppervlak van een glasplaatje, dienen als hybridisatiedoelen, waarbij de term “array” verwijst naar de regelmatige, rastervormige rangschikking van deze fragmenten. De fragmenten worden zo geselecteerd dat zij het menselijk genoom zo gelijkmatig mogelijk bestrijken.

Voor de analyse worden ongeveer gelijke hoeveelheden van het DNA van de patiënt en een referentie-genoom op de array gecohybridiseerd. Aangezien het DNA van de patiënt en dat van de referentie met verschillende fluorescente kleurstoffen zijn gelabeld, leidt een numerieke verandering in het genoom van de patiënt tot een kleurverschuiving in het fluorescentiesignaal van de afzonderlijke fragmenten via een verschuiving in de hybridisatieverhouding.

Schematische voorstelling van de array-CGH-techniek:

in de scanner worden de fluorescentiesignalen gedetecteerd en de kleurverschuivingen geregistreerd. Met de juiste software worden de signalen toegewezen aan de genregio en tenslotte kan het resultaat worden weergegeven, b.v. als een “karyogram”, dat laat zien op welk punt van een chromosoom veranderingen aanwezig zijn.

Weergave van een resultaat van de array CGH: verdubbeling van de regio Xp11-p21.1 (gemaakt in het ZMG met CGHAnalytics, Agilent)

Het aantal en de dichtheid van de fragmenten op de array bepalen de resolutie van de array CGH. Momenteel zijn er arrays beschikbaar met een dekking van het volledige menselijke genoom bij resoluties variërend van 1 Mb tot ongeveer 35 kb. Omdat het aantal fragmenten per array gestaag toeneemt, zal de resolutie blijven toenemen. Zo kunnen onevenwichtigheden van individuele genen op betrouwbare wijze worden opgespoord.

Toepassingen van array-CGH

Array-CGH is dus een techniek waarbij het volledige genoom van een patiënt met hoge resolutie kan worden gescreend op afwijkingen van de normale genendosering. Het wordt steeds belangrijker als innovatieve screeningmethode, hoewel het in de eerste plaats werd gebruikt in de diagnostiek van tumoren. Dit komt omdat tumorprogressie wordt gekenmerkt door een opeenstapeling van afwijkingen die gepaard kunnen gaan met amplificatie van oncogenen en deletie van tumorsuppressorgenen.

ArrayCGH is van bijzonder belang voor de diagnose van gevallen van onverklaarbare mentale retardatie. In de standaardcytogenetica zijn aberraties zichtbaar in ongeveer 5% van de gevallen bij patiënten met mentale retardatie en bijkomende tekenen van dysmorfie of familiale clustering. Subtelomere screening met FISH of MLPA kan in nog eens 5% van de gevallen een oorzaak vinden. Recente studies tonen aan dat array-CGH met een resolutie van ongeveer 1 Mb genomische onevenwichtigheden aan het licht brengt bij 10-15 % van de patiënten met een onopvallend karyotype en negatieve subtelomeerbevindingen. (zie literatuur). Aangenomen wordt dat deze detectiesnelheid zal toenemen naarmate de resolutie van de arrays toeneemt. Sommige onderzoeksgroepen bevelen array CH reeds aan als eerste diagnostische stap in gevallen van onverklaarde mentale retardatie.

Met array CH kunnen echter niet alleen nieuwe onevenwichtigheden worden opgespoord, maar kan ook de omvang van de deletie, de plaats van de breekpunten of de oorsprong van het extra materiaal nauwkeurig worden bepaald in gevallen van cytogenetisch zichtbaar verlies of winst van chromosomale gebieden. Dit is belangrijk voor een nauwkeurige genotype-fenotype correlatie en voor het identificeren van kandidaat-genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van MR en dysmorfie. Bij sommige chromosoomafwijkingen die vroeger als “gebalanceerde” translocaties werden beschouwd, heeft array-CGH aangetoond dat genetisch materiaal in de regio van de breekpunten is verwijderd of gedupliceerd en dat er dus sprake is van een onevenwichtige translocatie. Met behulp van array-CGH worden cytogenetische bevindingen dus nauwkeuriger en gecorrigeerd.

Dus, hoewel de grenzen tussen cytogenetica en moleculaire genetica steeds vager worden, blijft karyotypering belangrijk omdat bepaalde chromosomale veranderingen niet met array-CGH kunnen worden opgespoord: Polyploïdieën, echte evenwichtige translocaties en mozaïektoestanden met een klein aandeel afwijkende cellen.

Door de hoge detectiegraad over het volledige genoom en het feit dat geen tijd- en arbeidsintensieve celkweek nodig is, opent array-CGH nieuwe mogelijkheden voor de prenatale diagnostiek.

Maar bij alle voordelen en mogelijkheden van deze baanbrekende techniek mag men niet vergeten dat de sprong van onderzoek naar diagnostiek hier nog maar net wordt gemaakt. Zo verduidelijkt array-CGH niet alleen open vragen, de interpretatie van de resultaten kan ook nieuwe vragen oproepen:

Met array-CGH-studies is ontdekt dat het menselijk genoom een onverwacht hoog percentage regio’s bevat waarvan het kopiegetal bij fenotypisch normale mensen varieert (zie de literatuur). De omvang van deze CNV’s (“copy number variations”) varieert van enkele kilobases tot verscheidene megabases. Men schat dat elk individu ten minste 3-11 van dergelijke variaties draagt. Databanken met dergelijke polymorfismen (d.w.z. mutaties die geen duidelijke invloed hebben op het fenotype) worden nog maar pas aangelegd en zijn dus nog onvolledig. Als er nu met array-CGH afwijkingen in het DNA van een patiënt worden gevonden, is het vaak speculatief of deze überhaupt verantwoordelijk zijn voor het fenotype. In de meeste gevallen is het nodig om ook het DNA van de ouders te onderzoeken.

De kans dat een chromosoomafwijking ziekteveroorzakend is, neemt toe

• met de grootte van de afwijking
• als deze “de novo” aanwezig is, de ouders deze afwijking niet dragen
• als ze in geen enkele polymorfismedatabank voorkomt
• als er genen zijn aangetast die in verband kunnen worden gebracht met het waargenomen fenotype
• als gevallen met dezelfde of een soortgelijke afwijking bekend zijn die een soortgelijk fenotype vertonen.

Hoe meer array-CGH in de klinische diagnostiek zal worden gebruikt, des te waarschijnlijker zal het array-ontwerp zich aan de eisen van dit gebied aanpassen: Door bekende CNV-gebieden te vermijden en de voorkeur te geven aan chromosoomgebieden en genen die betrokken zijn bij mentale retardatie en dysmorfe syndromen, zullen de arrays steeds interessanter worden voor pre- en postnatale diagnostiek.

Ons instituut heeft de koers uitgezet om nu al te profiteren van de array-technologie en om toekomstige ontwikkelingen meteen te kunnen oppikken. Wij hebben gekozen voor technische apparatuur die ook arrays met de hoogste resolutie betrouwbaar en reproduceerbaar kan evalueren.

Neem contact met ons op als u gebruik wilt maken van onze diensten en ervaring op het gebied van array CGH. Wij informeren u graag over de duur van een dergelijk onderzoek, de kosten en de array-ontwerpen die momenteel kunnen worden gebruikt.

References

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Microarray gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie (array-CGH) spoort submicroscopische chromosoomdeleties en -duplicaties op bij patiënten met leerstoornissen/mentale retardatie en dysmorfe kenmerken. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostische genoom profilering bij mentale retardatie. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Opkomende patronen van cryptische chromosomale onevenwichtigheden bij patiënten met idiopathische mentale retardatie en multipele congenitale anomalieën: een nieuwe reeks van 140 patiënten en overzicht van de literatuur. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatale detectie van onevenwichtige chromosomale herschikkingen door array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Vergelijkende genomische hybridisatie en prenatale diagnose. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Structurele variatie in het menselijk genoom. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97