Het belang van fixatie
Om weefsels met een microscoop te kunnen bestuderen, moeten ze worden gepreserveerd (gefixeerd) en in coupes worden gesneden die dun genoeg zijn om doorschijnend te worden. Fixatie is een kritische stap in de voorbereiding van histologische coupes. Indien dit niet in optimale omstandigheden gebeurt of indien het fixeren wordt uitgesteld, kan een weefselmonster onherstelbaar beschadigd worden. Hoeveel zorg er vervolgens ook wordt besteed aan de bewerking van het weefsel, de microtomie en de kleuring, de morfologische en histochemische informatie die uit het specimen kan worden verkregen, zal in het gedrang komen.
De algemene doelstelling van weefselfixatie is cellen en weefselcomponenten in een “levensechte toestand” te bewaren of het levende weefsel zo weinig mogelijk te veranderen, en dit op zodanige wijze dat dunne, gekleurde coupes kunnen worden geprepareerd. De keuze van het fixeermiddel en het fixeerprotocol kan afhangen van de bijkomende verwerkingsstappen en de geplande eindanalyses. Er bestaat geen perfect fixeermiddel, al komt formaldehyde het dichtst in de buurt. Daarom zijn er verschillende fixatieven beschikbaar voor gebruik, afhankelijk van het type weefsel en de kenmerken die moeten worden aangetoond.
Type fixatie
Fixatie van weefsels kan worden bereikt met chemische of fysische middelen.
Fysische methoden omvatten verhitting, micro-waving en cryo-preservatie (vriesdrogen).
Chemische fixatie wordt gewoonlijk bereikt door het specimen in het fixeermiddel onder te dompelen (dompelfixatie) of, in het geval van kleine dieren of sommige volledige organen zoals een long, door het vasculaire systeem met fixeermiddel te perfuseren (perfusiefixatie). Voor sommige gespecialiseerde histochemische procedures worden fixeermiddelen soms in dampvorm toegepast. Zo kunnen paraformaldehyde en osmiumtetroxide worden gebruikt om gevriesdroogde weefsels in dampvorm te fixeren.
- Meer weten over populaire fixeeroplossingen
Mechanisme van fixatie
De twee belangrijkste mechanismen van chemische fixatie zijn cross-linking en coagulatie.
Cross-linking houdt in dat covalente bindingen worden gevormd, zowel binnen eiwitten als tussen eiwitten onderling, waardoor weefsel stijf wordt en daardoor bestand is tegen degradatie.
Coagulatie wordt veroorzaakt door de dehydratatie van eiwitten door het gebruik van alcoholen of aceton. Deze reagentia verwijderen en vervangen vrij water in cellen en weefsels en veroorzaken een verandering in de tertiaire structuur van eiwitten door hydrofobe bindingen te destabiliseren. Dit wordt ook wel denaturatie genoemd.
Factoren die de fixatie beïnvloeden
- Temperatuur: In het algemeen verhoogde een verhoging van de temperatuur de snelheid van fixatie, maar verhoogde ook de snelheid van autolyse en diffusie van cellulaire elementen. Traditioneel werd 0 tot 4 °C beschouwd als de ideale temperatuur voor het fixeren van specimens. Nu wordt fixatie routinematig uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Grootte: 1-4 mm dikte
- Volumeverhouding: Minstens 15-20 keer groter dan weefselvolume
- Tijd: 24 – 48 uur
- pH: Moet worden gehouden in het fysiologische bereik, tussen pH 4-9. De pH voor het behoud van de ultrastructuur moet worden gebufferd tussen 7,2 tot 7,4.
Protocols
- Methods and Protocols for Decalcification of Bone Material
- Standard Protocol for Formalin-Fixed Paraffin Embedded Tissue
Useful Links
- The Process of Fixation and the Nature of Fixatives
- Popular Fixative Solutions
- Basic Introduction to Histology
- National Society for Histotechnology
- An Introduction to Decalcification
- A Practical Guide to Good Histology Practice