Virus y células
A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron utilizando un virus de la gripe clínica aislado en células MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) proporcionado amablemente por el Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) . Los virus descritos en la Fig. 5 fueron proporcionados amablemente por los colegas mencionados en los agradecimientos.
Las células MDCK y las células MDCK-SIAT1 transfectadas de forma estable con la 2,6-sialiltransferasa para mejorar la expresión de oligosacáridos terminados en Neu5Ac2-6Gal se describieron previamente . Propagamos ambos tipos de células en DMEM (Gibco) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal de ternera y antibióticos (estreptomicina, 100 mg/ml y penicilina, 100 U/ml).
Medio de cultivo
Como medio líquido de mantenimiento (MM) para la infección del virus, se utilizó MEM de Eagle que contenía L-glutamina, 0,1% de BSA (Sigma, A-0336), antibióticos y 1 μg/ml de tripsina TPCK (Sigma, T-1426).
Se prepararon existencias de Bacto-Agar al 1,8 % (BD, 214010) y metilcelulosa al 2 % (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s al 2 %, Fluka) en agua destilada como se ha descrito anteriormente.
El fabricante de Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) proporcionó amablemente tres tipos de Avicel (RC-581, RC-591 y CL-661) para las pruebas. Preparamos suspensiones madre de Avicel dispersando 2,4 g de Avicel en polvo en 100 ml de agua destilada en un agitador magnético estándar durante 1 hora. Las existencias de agar, MC y Avicel se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 121°C y se almacenaron a temperatura ambiente.
Las superposiciones se prepararon mezclando soluciones madre de MC, Avicel o agar fundido con volúmenes iguales de medio de mantenimiento de doble fuerza. Para variar la concentración de MC y Avicel en las superposiciones, diluimos las existencias originales con agua estéril. La superposición de agar se preparó a 42-44°C, mientras que las otras dos superposiciones se prepararon a 20 o 37°C.
Las existencias de Avicel concentradas (2,4%) normalmente no se separaron durante el almacenamiento; sin embargo, las superposiciones diluidas a base de Avicel fueron menos estables. Si se consideraba necesario, se mezclaban las existencias de Avicel y siempre se mezclaban las superposiciones de Avicel antes de su uso, agitando con la mano o agitando en vórtex. La separación lenta de los recubrimientos después de su aplicación en las monocapas celulares no afectó a los resultados del ensayo.
Ensayo de placa en placas de 6 pocillos
Una hora después de infectar las monocapas celulares con 30-50 unidades formadoras de placa del virus en 1 ml de medio de mantenimiento sin tripsina, retiramos el inóculo del virus, cubrimos las células con 3 ml de los diferentes medios de recubrimiento e incubamos los cultivos a 35°C en una atmósfera de CO2 al 5%. En el caso de las superposiciones de MC y Avicel, se tuvo cuidado de no perturbar las placas durante el período de incubación para evitar la formación de placas no uniformes. Tras tres días de incubación, se retiraron las superposiciones y se fijaron las células. La superposición de agar se retiró utilizando una espátula metálica; las superposiciones de MC, Avicel y líquido se retiraron mediante succión. Las células se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% en MEM durante 30 minutos a 4°C y se lavaron con PBS. Todos los tratamientos posteriores de las células se realizaron a temperatura ambiente. Permeabilizamos las células y simultáneamente bloqueamos los grupos aldehídos residuales incubando las células durante 10-20 min con 1 ml/pocillo de solución que contenía 0,5% de Triton-X-100 y 20 mM de glicina en PBS. Las células infectadas por el virus se inmunizaron incubando durante 1 hora con anticuerpos monoclonales específicos para la nucleoproteína del virus de la gripe A (proporcionados amablemente por el Dr. Alexander Klimov de los Centros para el Control de Enfermedades, EE.UU.), seguidos de 1 hora de incubación con anticuerpos anti-ratón marcados con peroxidasa (DAKO, Dinamarca) y 30 minutos de incubación con sustratos de peroxidasa formadores de precipitados. Para la preparación de las diluciones de trabajo de los inmunorreactivos se utilizó una solución de suero de caballo normal al 10% y Tween-80 al 0,05% en PBS. Se lavaron las células después de los anticuerpos primarios y secundarios incubándolas tres veces durante 3-5 minutos con Tween-80 al 0,05% en PBS. Como sustratos de peroxidasa, empleamos True Blue™ (KPL) listo para usar o una solución de aminoetilcarbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) preparada en tampón de acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5 y que contenía 0,03% de H2O2. Las placas teñidas se lavaron con agua del grifo para detener la reacción y se secaron. En el caso de la tinción True Blue, que es relativamente inestable en soluciones acuosas, las placas se secaron invertidas para minimizar el blanqueo. Las placas teñidas se escanearon en un escáner de cama plana y los datos se adquirieron con el software Adobe Photoshop 7.0.
Como alternativa a la inmunotinción, en algunos experimentos revelamos las placas como áreas de células destruidas. Para ello, tras eliminar las superposiciones, teñimos las células con una solución de violeta de cristal al 1% en metanol al 20% en agua.
Variantes de la valoración del virus en placas de 96 pocillos
1. Variante estándar
Infectamos monocapas de células MDCK o MDCK-SIAT1 en placas de 96 pocillos con 50 μl/pocillo de diluciones seriadas del virus en el medio de mantenimiento sin tripsina. Después de 1 h de incubación a 35 °C en un 5% de CO2, se retiró el virus, se añadieron 100 μl/pocillo de medio de superposición MC o Avicel y se incubaron las células durante otras 24 h para permitir la formación de placas. La fijación y la inmunotinción se realizaron como se ha descrito anteriormente para las placas de 6 pocillos, pero utilizando 50 μl de reactivos por pocillo.
2. Variante simplificada
El ensayo se realizó exactamente como en la variante estándar con las siguientes modificaciones. Tras 1 h de incubación con el virus, no eliminamos el inóculo. Añadimos 100 μl/pocillo de medio de superposición Avicel y mezclamos la placa dando golpecitos con la mano o utilizando un mezclador de placas. Los medios incluían cantidades aumentadas de tripsina (1,5 μg/ml) para compensar la dilución de la superposición con el material que contenía el virus presente en los pocillos.
Asayo de inhibición de la laca
Noel Roberts (Roche Products, Reino Unido) proporcionó amablemente el inhibidor de la neuraminidasa oseltamivir carboxilato (OC). Añadimos 50 μl/pozo de diluciones seriadas de 10 veces de OC en medio de mantenimiento sin tripsina (rango de concentración de 4 nM a 400 μM de OC) a monocapas de células MDCK-SIAT1 en placas de 96 pocillos. A continuación, añadimos 50 μl/pocillo de diluciones de virus (20-40 unidades formadoras de placas por pocillo). Mezclamos la placa y la incubamos durante 1 h a 35 °C para permitir el inicio de la infección viral. Después, añadimos 100 μl/pocillo de medio de superposición de Avicel al 1,2% que contenía 2 μg/ml de tripsina, incubamos los cultivos durante 24 h y los fijamos e inmunoteñimos como se ha descrito anteriormente.
En el caso de las placas de 6 pocillos, añadimos alícuotas de 0,75 ml del fármaco y del inhibidor y 1,5 ml de Avicel por pocillo e inmunoteñimos las placas 3 días después de la infección.